直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南

——生理生化检测：包括碳源利用、氮源利用、氧化酶反应、过氧化氢酶反应等关键生理生化特征检测。

——分子生物学分析：如 16S rDNA 序列、持家基因序列或WGS 等分析。对于新饲料添加剂申报、进口饲料添加剂登记及其他需要依照新饲料、新饲料添加剂评审程序评审的产品申报的，应利用 WGS 数据进行分析鉴定。

5.1.2.2 酵母菌鉴定

综合形态观察、生理生化检测、分子生物学分析对酵母菌进行鉴定。

——形态观察：包括菌落质地、颜色、边缘等宏观形态观察，以及菌体大小、形状、是否有真假菌丝、生殖方式等微观形态观察。

——生理生化检测：包括碳源利用、糖类发酵、氮源利用等关键生理生化特征检测。

——分子生物学分析：如 26S rDNA、ITS rDNA 等特征序列或 WGS 分析。

5.1.2.3 丝状真菌鉴定

综合形态观察、分子生物学分析对丝状真菌进行鉴定。

——形态观察：包括菌落的质地、颜色、生长速度、色素的产生等宏观形态观察，以及菌丝的颜色、产孢结构的大小及发生方式、孢子颜色、形状、是否具有有性生殖结构等微观形态观察。

——分子生物学分析：如 18S rDNA 序列、ITS rDNA 序列及其他特征基因（如微管蛋白基因、钙调蛋白基因、翻译延伸因子等）序列或 WGS 分析。

5.2 WGS 测序

采用二代和三代测序技术对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株进行全基因组测序，获得其基因组框架图和完成图，测序报告至少应包括以下信息：DNA 提取方法；测序方案和仪器；序列组装方法，如生物信息学方法、从头测序或重测序等；序列质量评价，如平均 Phred得分、reads 数目、覆盖度、N50 和 K-mer 等；WGS 的 FASTA 文件；相对于预期基因组大小的 contigs 总长度；基因注释方法；对于酵母和丝状真菌，还需提供从相关数据库（如 BUSCO 数据库）获得的注释质量信息。

5.3 产毒能力和致病性

应通过国内外安全性评价资料综述、WGS 分析和动物致病性试验对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的产毒能力和致病性进行综合评价，其中丝状真菌还应开展产毒试验。鉴于屎肠球菌（Enterococcus faecium）和芽胞杆菌（Bacillusspp.）的致病性风险比较清晰，已有成熟的致病性评价方法，可分别按 5.3.6 和 5.3.7 开展评价。

5.3.1 国内外文献资料综述

通过国内外文献数据检索（具体要求见附录 B），收集整理菌株的国内外使用历史、安全性评价资料，包括对人和靶动物的产毒能力和致病性的相关信息；若无该评价菌株的上述资料，应收集整理同种内其他菌株或与其相近种属的相关信息。若对菌株进行了任何降低毒性和致病性的选育（包括诱变和/或遗传修饰），应予以说明。

5.3.2 WGS 分析

5.3.2.1 细菌

将菌株 WGS 与最新数据库（包括但不限于 VFDB、PAI DB、MvirDB、CGE 等）中存储的序列进行比对，分析菌株遗传物质中是否存在已知毒力因子的编码基因。分析结果重点关注该种或近缘种中已知毒力因子（如毒素、入侵与粘附因子）的完整编码基因。结果以表格形式表示，至少应包括如下信息：基因名称、定位（染色体或质粒）、编码蛋白的功能、覆盖度（序列长度覆盖度≥70%）、相似性百分比（输入序列与数据库中序列的匹配度≥80%）和 e 值（＜10-5）等。

5.3.2.2 酵母和丝状真菌

若菌株有 WGS 数据，则通过定向搜索确定菌株是否存在与产毒性相关的已知代谢途径。

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