规范标准

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法(团体标准)

日期:08-09 作者:倪建强、王传彬等- 小 + 大

三、附录C(规范性附录)非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照

C.1阳性对照

阳性对照制备方法:人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段,序列参见附录B,将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72,使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L,保存于-20℃备用。

C.2 阴性对照

阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。

四、附录D(规范性附录)实时荧光PCR反应液配方

实时荧光PCR反应液配方见表D.1。

表D.1  实时荧光PCR反应液配方

组 分

1个检测体系的加入量

2×PCR  缓冲液a

12.5μL  

dNTP(2.5 mmol/L)

1.0  μL

上游引物(10 μmol/L)

1.0  μL

下游引物(10 μmol/L)

1.0μL  

探针(10 μmol/L)

1.0  μL

Taq  酶b(5U/μL)

0.5μL  

去离子水

3μL  

总体积

20μL  

2×PCR  缓冲液a: 参见附录A.1配方。

Taq 酶b:具有5’→3’外切活性。

五、附录 E(资料性附录)非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考

图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。

图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图

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