非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法（团体标准）
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6.2 结果描述及判定 当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。 7、实验室生物安全要求 7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。 7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。 一、附录 A (规范性附录) 试剂的配制 A.1 DNA提取液1 PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。 A.2 DNA提取液2 1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。 即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。 A.3 2×PCR缓冲液 灭菌去离子水 70 mL 三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g 氯化钾 1.865 g 曲拉通X-100 0.5 mL dATP (100mmol/L) 2.5 mL dTTP (100mmol/L) 2.5 mL dGTP (100mmol/L) 2.5 mL dCTP (100mmol/L) 2.5 mL 六水氯化镁 0.61 g 盐酸 调pH至9.0 灭菌去离子水 加至100 mL A.4 消毒液 8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。 A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方 A.5.1 A液 0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。 A.5.2 B液 0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。 A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。 A.6 无DNA酶的灭菌去离子水 无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。 |