非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法（团体标准）
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团体标准T/CVMA 5—2018 非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法 Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus 前言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。 本标准主要起草人：倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。 非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法 1、范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。 本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。 2、规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3、试剂 3.1 DNA提取试剂 DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。 3.2 2 × PCR缓冲液 2 × PCR缓冲液的配制见附录A。 3.3 引物探针 3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针： 上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3' 下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3' 荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3' 3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作： 上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3' 下游引物ASF-OIE-rPCRR： 5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3' 荧光探针ASF-OIE-Probe： 5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3' 3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。 3.4 阴性及阳性对照 阴性及阳性对照的制备方法见附录C。 3.5 其他试剂 消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。 消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。 |