动物营养
禽用微生态制剂的研究和应用现状
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菌株筛选一般考虑3方面：1)是否产孢子，细菌的孢子具有很强的抵御外界不良环境的能力，易于加工、保存期长及存活率高；2)是否为动物消化道的固有菌，许多细菌具有宿主的特异性，动物机体对外界入侵的非共生微生物具有排斥反应；3)是否产酸，产酸细菌所造成的酸性环境既可抑制病原菌生长，又有利于动物机体对营养物质的消化吸收，提高饲料利用率。 获得生产性能稳定的纯菌株后可采用多种方法提高菌体发酵密度，如：优化培养基(优化碳氮源、选择优化培养、液体发酵或固体发酵、调节发酵液的溶氧和pH等)、优化培养条件(培养温度、摇床转速、转接量和转接菌龄等)和优化培养方式(菌体游离培养或固定化培养和单独培养或混合培养等)等。在优化发酵条件的过程中，可通过一些统计学软件(SPSS和SASS)进行各项结果的分析比较，包括活菌数、发酵液的残糖、发酵液的蛋白含量和菌体蛋白含量等指标。活菌数通过OD值反应，结合活菌数与OD值的关系曲线进行推算；残糖采用DNS法、高效液相色谱法(HPLC)、苯酚硫酸法和碘量法等进行检测；发酵液蛋白含量的检测有考马斯亮蓝法、双缩脲法、水杨酸比色法、凯氏定氮法和福林-酚法等。 发酵密度达到预期指标后可对发酵液进行后处理。为了避免发酵液中的代谢产物对食用动物造成的不良反应，一般离心发酵液后弃上清，用灭菌氯化钠注射液洗涤菌体，洗涤后的菌体或结合保护剂或直接进行冷冻干燥或喷雾干燥，制成粉末或颗粒。由于是活菌干燥，所以需要对菌体保护剂和干燥工艺等进行优化，以益生菌的存活率作为评价指标对干燥过程的关键因素进行优化和调控。存活率的检测主要是通过活菌平板计数法实现。 在制剂的制作过程中，除了控制终产品中益生菌的活菌数，还必须控制制剂中有害菌的滋长，制剂中可能存在的有害菌主要包括，霉菌、大肠杆菌和沙门菌等，这些有害菌均需参照国标中的先关检测方法进行检测，并进一步将其数量控制在相关国标允许的标准范围内。 优质的微生态制剂应具有以下标准：1)制剂所含的活菌量每毫升至少要达到0.1亿~100亿个/g。2)菌株应是稳定、安全和可靠的。3)菌株能在肠道中定殖并繁殖，并具有抗酸、抗胆盐和抗环境变异的能力。4)制剂应具有提高生产率和抗病的有益作用，能够长期储存，并且性能稳定。 4.2微生态制剂生态学效应的研究方法 微生态学中的生态学效益狭义上指微生态制剂对饲喂动物生长性能的影响，主要包括提高肠道对饲料的吸收率、维持肠道菌群平衡、提高机体免疫机能及改善养殖环境和养殖动物体内的氨代谢等。 观察饲料吸收率，一方面可通过料肉比这个最为直接的数据来反应，所谓料肉比，就是平均耗料量与平均增质量的比值。即通过一定时间的饲喂后，通过增质量和耗料量的比值计算各个组的料肉比，通过软件分析，比较各组数据间的差异性，从而确定微生态制剂的添加对料肉比的影响。另一方面可通过观察试验动物肠道中消化酶类(脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶等)酶活特性的改变来验证制剂的有效性，将各组酶活数据经过统计软件分析其差异显著性后即可判断制剂的有效性。动物试验中采取的饲喂方式是将微生态制剂与饲料搅拌饲喂，或微生态制剂溶入饮用水中，或二者同时进行，对照组饲喂正常日粮和饮用水。但通常这样的饲喂形式一般是适合于研究禽畜，目前微生态制剂也被广泛应用于水产养殖，在研究其对水产动物的影响时考虑到微生态制剂投入水中质量浓度降低的问题，也可采用饲喂前经过微生态制剂灌胃的活食。这个喂食方式可被借鉴到以活食为辅食的饲养动物研究中。 料肉比及酶活变化情况只能大致反应出各个试验组间消化率的增减趋势，但若要进行定量对比，一般是比较各个试验组养分表观代谢率。养分表观代谢率主要的指标有干物质、粗蛋白、有机物、钙和磷等，参照杨胜的方法，比较饲料中和干燥粪便中的相对含量，计算出蛋鸡日粮中干物质、粗蛋白、有机物、钙和磷的消化率。 微生态制剂对肠道菌群平衡的影响，主要是观察饲喂微生态制剂后肠道中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、消化球菌、肠球菌、梭菌、芽孢杆菌和沙门菌等的数量变化。最为常用的比较传统的方法是在喂食前后取下肠道的一部分内容物定量称质量后进行梯度稀释并涂布于选择培养基上。选择培养基主要是用于选择性富集大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸菌和芽孢杆菌等。以上方法较为传统，但很多实验室在处理肠道时往往很难达到无菌水平，以至于影响试验结果。比较方便的方法是通过定期采集每个试验组的粪便，将其稀释后根据平板计数法，在选择性培养基中对各种菌落数进行比较，通常这种方法一般是比较各个试验组中大肠杆菌和芽孢杆菌含量的变化，菌落数有所减少的试验组说明该种菌在肠道的竞争性环境中处于不利位置，相反则说明其在肠道中取得了优势地位。这种统计方法较为粗略，但也能反应肠道中微生物菌群的变化情况。随着分子生物学技术的发展，Northern Blot、半定量RT-PCR、荧光定量PCR和基因芯片等技术也应用于菌群数量的鉴定。荧光定量PCR在学术界和临床诊断都被广泛采用，该技术能较真实反应基因的表达水平，实时监控PCR扩增，数据处理自动化和数字化。 微生态制剂对于机体免疫力的影响，主要采用以下几种方法进行观察：1)最直接的是比较各试验组的出栏率和腹泻率，所谓出栏率是指禽畜出栏的数量与初期畜禽数量的比值，若机体免疫力提高则出栏率就较高，腹泻率则相对较低；2)在比较出栏率和腹泻率的基础上，还可以比较各试验组动物机体内免疫器官的质量，通常情况下免疫器官的质量和机体免疫力成正比；3)另外，机体免疫力与机体抗疲劳程度成正相关，有些实验室通过运动性试验对微生态制剂提高机体免疫力效果进行验证，如：负重游泳试验，通过检测其运动持续时间、肝糖原和血乳酸等指标进行观察；4)以上3种是较为粗放的检测手段，一些条件设备比较好的研究机构可以做一些更为细化和精确的观察，如：采用免疫荧光法检测肠道黏膜、支气管、乳腺及血清中的IgA、CD4+和CD8+淋巴细胞；也可以通过一些酶促反应来检测血液中溶菌酶活性的改变。 |
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