兽医战略
家畜性别控制技术的研究进展
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家畜性别控制是指通过人为的手段进行干预,使雌性繁殖动物按人们的意愿繁殖出特定性别后代的技术。在畜牧生产中,由于很多生产性状受性别的控制,如母牛的产奶性状、母鸡的产蛋性状和公鹿的产茸性状等,所以人们希望能够人为的控制出生动物的性别,得到更高的经济效益。从20世纪初,人们就开始探索动物性别决定的机理,寻找控制动物性别的有效手段。目前,家畜性别控制主要采用两种途径,一种是X、Y精子的分离,一种是胚胎性别的鉴定。 1、X、Y精子的分离 Lush(1925)利用精子分离的方法进行性别控制研究,首次报道了用离心法分离兔X、Y精子,而授精结果发现后代性别比例无显著改变。在此后的半个多世纪里,人们就开始寻找分离X、Y精子的有效方法。人们依据X、Y精子间存在的物理学、生物化学及免疫学的性质差异,如密度、活力、表面电荷和表面抗原等差异,运用了电泳法、白蛋白柱分离法、上游法、Percoll密度梯度离心法、Sephadex柱分离法及H2Y抗原法等诸多方法进行X、Y精子的分离。由于当时缺乏直观而准确的评估手段,这些分离方法的有效性一直存在着争议。直至Johnson等将荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH)技术和流式细胞仪成功应用于精子分离,人们才找到了分离X、Y精子的有效方法。流式细胞仪分离法被证实是目前为止最有效的精子分离方法(Johnson等,1999)。 流式细胞仪分离法主要依据X、Y精子的DNA含量不同。一般来说,X精子比Y精子含有较多的DNA,所以用荧光染料Hoechst33342染色时,X精子吸收的染料多,发出的荧光也强,因此可以分辨出X与Y精子,再利用计算机控制使荧光强的X精子带上正电荷,Y精子带上负电荷,然后使其通过高压电场,X、Y精子发生不同方向的偏转,从而达到分离目的,分辨率可达90%(Paul,2003)。 Gledhill等(1976)首先报道使用流式细胞仪测定精子的DNA。几十年来,人们在该领域的研究中取得了进展,获得了关于分离X、Y精子的知识,成功地证实了DNA是分离有活性的X、Y精子的有效标记,为最终利用改良的流式细胞仪分离X、Y精子打下了基础。1989年,Johnson等首先报道用流式细胞仪成功分离了兔子X、Y精子,用分离的精子授精后产下预期性别比例的后代,这标志着流式细胞仪分离精子技术的研究取得了重大突破(Johnson等,2000)。此后,Johnson等又不断改进流式细胞仪,并利用改进后的流式细胞仪分离有活性的X和Y精子。流式细胞仪分离精子的方法在不断地改进,速度不断地提高。随后流式细胞仪被应用到猪、牛、羊以及人的研究上,均获得较大成功,精子分离纯度可达85%～95%。1993年,Gran等使用流式细胞仪分离的牛精子用于体外受精,将胚胎移植给9头受体牛,其中4头妊娠,产犊6头,3头母牛,3头公牛,均与预测性别相符。Seidel等(2000)用流式细胞仪分离法分离牛精子,用X精子输精后所产犊牛的性别准确率为83%,而Y精子为90%。 2000年,英国科肯特精子分离公司首次将流式细胞仪分离精子技术投入生产。2000年7月,科肯特公司正式宣布为其下属的牧场提供奶牛分离精子的服务。流式细胞仪分离技术开始从实验室成功进入商业化生产应用。Gordon报道,英国科肯特精子分离公司用分离后的精子进行奶牛人工授精,结果平均怀孕率可达52%。 我国精子分离技术的研究工作起步较晚,但近年来发展迅速。2001年10月,黑龙江省大庆市田丰生物工程公司注册成立并率先进行精液分离研究。2003年11月,我国第一头性控奶牛犊在该公司顺利诞生。性控冻精在我国已进入试验、示范和科技推广阶段。最近,人们又将原有的流式细胞检索分离仪进行改进,研制出了高速细胞检索分离仪,使包含有精子的液滴产率提高。在喷嘴的设计上,检测系统更接近喷嘴处以使被定位的精子达到更高的比例,同时,新的喷嘴设计可每小时分离1100万个X精子,纯度仍可达到85%～90%。目前该技术已被动物和人精子的分离系统所采用。 2、胚胎性别的鉴定 胚胎的性别鉴定是实现人为控制出生家畜性别的主要途径之一。现在能够实现胚胎性别鉴定的技术很多,而且已经达到成熟。但是这些方法存在准确率不高、费时或试验费用昂贵等不足。随着研究的深入和现代分子新技术的出现,胚胎性别鉴定较为有效、准确和快速的并且具有一定发展和推广前景的方法有以下几种。 2. 1 染色体组型鉴定法 染色体组型鉴定法是一种经典的胚胎性别鉴定方法。该方法是在动物胚胎滋养层上取少量细胞,经乙酰甲基秋水仙碱培养基培养,使有丝分裂停留在中期,通过渗透压使细胞膨胀破裂,释放出染色体并加以固定、染色,在显微镜下检查其核型。该方法主要是通过核型分析对胚胎性别进行鉴定。1976年,Hare等报道用染色体组型鉴定法鉴定14～15日龄的牛胚胎,其中有58.5%可以鉴定,将鉴定的胚胎移植后获得预期性别的犊牛。采取此方法鉴定胚胎性别准确率可达100%。由于该方法存在技术要求高、胚胎浪费大、耗时长和重复性差的缺点,因此不适于生产应用。目前,该方法主要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。 2. 2 免疫学方法 免疫学方法是利用H2Y抗血清或H2Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H2Y抗原,从而鉴定出胚胎性别的一种方法。这种雄性特异因子已成为免疫学方法鉴别多种动物胚胎性别的基础。对胚胎的H2Y抗原检测有3种方法细胞毒性分析法、间接免疫荧光法、囊胚形成抑制法(罗承浩等,2004)。其中较为有效的方法是间接免疫荧光法。间接免疫荧光法是将82细胞至囊胚期胚胎在H2Y抗血清或单克隆抗体中培养30min,再与硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的第二抗体进行反应,然后在荧光显微镜下观察,有荧光素的胚胎为雄性,否则为雌性。1984年,White等用此方法鉴定牛胚胎,有荧光的产犊后85%为雄性,无荧光的97%为雌性。间接免疫荧光法的优点是不损害胚胎且准确率较高。该方法在猪、绵羊、牛胚胎性别鉴定中准确率分别可达81%、85%和89%(朱晓华等,2001)。 |
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