奶牛乳房炎防治技术指南

附件2：

 

　  引起临床型乳房炎或者亚临床型乳房炎的链球菌常见的有无乳链球菌、停乳链球菌以及乳房链球菌。

　  1主要试剂和试验方法

　  CAMP试验：在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养物划一条直线，然后将链球菌培养物划一条线，与金黄色葡萄球菌培养物的划线相互垂直，但不要接触，二者相距3-5mm，各链球菌分离菌划线间距l0～20mm。置37℃温箱内培养24h后观察结果。在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。

　  2乳样的采集

　  选取出现临床症状(或者怀疑为亚临床型乳房炎)乳房炎奶牛，先用温水，再用0.2％新洁尔灭擦洗乳房，最后用70％的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头2～3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样5mL于无菌乳样杯中，待检。

　  3病原菌的分离培养

　  初步诊断：将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为链球菌。

　  分离培养：将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤(10％血清)、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基(平板)后，置于37℃温箱培养24～48h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。

　  普通琼脂平板上，37℃，24～72h培养后，未见到菌落。

　  鲜血琼脂平板上长有灰白色、半透明表面光滑圆形隆起的小菌落，出现溶血现象，如果是β溶血则疑为无乳链球菌，如果为α溶血，疑为停乳链球菌或者乳房链球菌，如为γ溶血，则疑为乳房链球菌。

　  血清肉汤中生长初呈均匀浑浊，管底出现絮状沉淀，上清变得透明。

　  挑取典型菌落涂片、染色、镜检，镜检如呈球状，短链状或者长链状排列，无芽胞、荚膜，革兰氏染色阳性则疑为链球菌。

　  4生化鉴定

　  镜检形态符合链球菌特性，且触酶试验阴性细菌，即鉴定为链球菌属细菌。若细菌CAMP试验阳性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为无乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为停乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为乳房链球菌。

　  5动物试验

　  对实验动物，只有停乳链球菌具有致病性，将其18h血清肉汤培养物0.5mL注入小白鼠腹腔，或给家兔静脉接种l～2mL，可使动物在1周内死亡。对接种后发病、死亡小鼠(家兔)的肝脏进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。如果是则进一步确定病原菌为停乳链球菌。其他两种链球菌并不能使试验动物致死。

 

 

附件3：

 

　  推荐使用体细胞计数仪进行乳汁体细胞计数。

　  体细胞计数法有直接计数法和间接计数法。直接计数法中简便易行的方法是直接用显微镜进行体细胞计数(SCC)，间接计数法就是后面提到的CMT。法。

 　 l主要试剂和材料

　  美蓝染色液：美蓝乙醇饱和溶液30mL．(美蓝2g，95％乙醇100mL)，10％氢氧化钠溶液0.1mL，蒸馏水100mL，将上列溶液混合摇匀，过滤后备用。二甲苯、95％乙醇。生物显微镜、载玻片、l0μL。微量加样器(或移液枪)等。

　  2操作方法

　  2.1涂片制备

　  涂布：充分摇匀新鲜乳样，用l0μL微量加样器吸取中部乳汁l0μL，或用接种环蘸取等量的乳汁，将乳样滴于玻片一端中侧，仔细涂布成约lcm²。面积的乳膜(为便于操作，可在玻片下垫衬一张硬纸板，纸板上用毛笔划数个面积为lcm²的方格透视)。

　  干燥、脱脂、固定：涂好乳膜的玻片于37℃温箱中干燥，然后用二甲苯脱脂5min，再置95％乙醇中固定5～10min。

　  染色：玻片干燥后，用美蓝染色液染色5min。水洗，再用95％乙醇脱色数分钟，水洗干燥后镜检。

　  镜检及计数：在生物显微镜油镜下观察(最好用l0×目镜，其视野直径要求为0.016)，计数100个视野内的细胞数，然后用下式计算：SCC=100xN／Лr²

　  视野面积Лr²=3.1416×(0.016／2)²。=0.0002cm²，

　  显微镜系数N=I／0.0002×100=500,000

　  SCC=系数×每个视野的细胞平均数(即细胞总数÷100)：细胞数／mL乳。

　  3判定标准

　  随着国际和国内乳品行业的接轨，国内标准也在提高，一般以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床乳房炎的临界值(+)；超过该值为阳性，低于该值则正常。

　

附件4：

加州乳房炎检测法(CMT) 

　  CMT是加州乳房炎试验的简称，即首先在美国加利福尼亚州使用的一种乳房炎检测试验。它是通过间接测定乳中体细胞数(SCC)来诊断隐性乳房炎的方法。其原理是在表面活性物质和碱性药物作用下，乳中体细胞被破坏，释放出DNA，进一步作用，使乳汁产生沉淀或形成凝胶。体细胞数越多，产生的沉淀或凝胶也越多，从而间接诊断乳房炎和炎症的程度。该法是国际通用的隐性乳房炎诊断方法，其特点是简便、快速。我国研制出了类似的方法如BMT(北京奶牛研究所)、SMT(上海奶牛研究所)、HMT(黑龙江省兽医科学研究所)，以及LMT(中国农科院兰州兽医研究所)

等。

　  1试剂和方法

　  CMT检测中用到的试剂和方法如下：十二烷基磺酸钠30g溶解于1000mL蒸馏水，用2M的氢氧化钠调节PH等于6.4，加入溴甲酚紫0.1g，即成CMT检验液，取乳房炎诊断盘1只，滴加被检乳2mL，诊断液2mL，缓缓作同心圆状摆。市售成品CMT诊断试剂或者其他方法的成品试剂，按照说明操作。

　  2判定标准：可以参考表l。

 

 

表1 CMT法的判定方法及标准