直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南

5.4.1 表型试验

至少对菌株进行附录Ａ所列抗菌药物 MIC 值的测定。对于附录 A 中未列出的细菌，革兰氏阳性菌应选择附录 A 中“棒状杆菌和其他革兰氏阳性菌”规定的抗菌药物，革兰氏阴性菌应选择附录A 中“肠杆菌科”规定的抗菌药物。

MIC 值测定应采用琼脂或肉汤二倍梯度稀释法进行定量测定，采用国际或国内标准方法，如 EUCAST、CLSI、ISO、WS等标准方法。除非抗菌药物不适用定量方法进行测定，否则不得采用定性或半定量方法（如扩散法）间接测定 MIC 值。MIC 值测定通常应选择药物敏感性试验专用培养基，如Muelle-Hinton 或 IsoSensitest 培养基。对于某些特定菌种或菌株，可以根据微生物特性选择其他针对性培养基，如某些乳酸菌和双歧杆菌的乳酸菌药物敏感性试验培养基（LSM）。试验过程中应同时关注培养基组分（如对氨基苯甲酸、胸苷、甘氨酸、二价阳离子等）、试验类型（肉汤微量稀释或琼脂稀释）和培养条件（如pH、温度、培养时间）等因素对某些抗菌药敏感水平的潜在影响。

通过将测定的MIC值与附录A中给出的各抗菌药物的临界值进行比较，以区分耐药菌株和敏感菌株。

——MIC 值≤临界值时，认为菌株对该抗菌药物敏感；

——MIC 值＞临界值时，认为菌株对该抗菌药物耐药。

对于附录 A 中未列出的细菌，测定的 MIC 值应与该种或相关种的已发表文献值进行比较。

5.4.2 WGS 耐药基因分析

对菌株 WGS 进行分析，检测对用于人或动物的抗菌药物（世界卫生组织（WHO）发布的极为重要抗菌药物（CIAs）或高度重要抗菌药物（HIAs））耐药的编码基因或起促进作用的基因。对菌株 WGS 进行分析时，应将其与最新耐药基因分析数据库进行比对，如 CARD、ARG-ANNOT 和 ResFinder 等。分析结果以表格形式表示，重点关注抗菌药物耐药性完整编码基因，至少应包括如下信息：基因名称、定位（染色体或质粒）、编码蛋白的功能、覆盖度（序列长度覆盖度≥70%）、相似性百分比（输入序列与数据库中序列的匹配度≥80%）和 e 值（＜10-5）等。

5.4.3 结果分析

5.4.3.1 当测定的 MIC 值≤临界值（附录 A），若通过 WGS 分析未发现选定抗菌药物的耐药基因，则认为菌株不具有获得性耐药；若通过 WGS 分析检测到选定抗菌药物的耐药基因时，应评估耐药基因变为活性基因的可能性（如与活性基因序列进行比较），并进行综合判断。

5.4.3.2 当测定的 MIC 值＞临界值（附录 A），若通过 WGS分析未发现与选定抗菌药物表型相关的已知耐药基因，则认为菌株不具有危害；若通过 WGS 分析检测到与抗菌药物表型直接相关的已知耐药基因，则认为菌株具有危害。

5.4.3.3 对所有菌株，若通过 WGS 分析，发现存在除附录 A中选定抗菌药物以外的其他 CIAs 或 HIAs 的耐药基因，则应分别测定对应抗菌药物的 MIC 值，并与文献值进行比较：

——当 MIC 值≤文献值，应评估耐药基因变为活性基因的可能性（如与活性基因序列进行比较），并进行综合判断；

——当 MIC 值＞文献值，则认为菌株具有危害。

5.5 抗菌药物产生

应对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株是否产生人或动物用抗菌药物进行评价，已知不产生人或动物用抗菌药物的微生物菌种除外。产品生产过程中若使用任何临床用相关抗菌药物，应予以说明。

应评价培养物上清液对抗菌药物敏感的参考菌株的抑菌活性。推荐 GB4789.43、EUCAST、CLSI 等相关方法中的参考菌株，也可使用国家级菌种保藏中心的等效菌株，也可根据实际生产情况增加参考菌株。若检测结果显示拟评价菌株培养物上清液对一种或一种以上参考菌株出现抑菌活性，应对抑菌物质进行鉴定，确定其是否为人或动物用抗菌药物。

若用于发酵制品的生产菌株能产生人或动物用抗菌药物，应证明发酵制品中无抗菌药物残留。应明确说明用于抗菌药物残留检测样品的具体采样阶段。样品应来自工业化生产线，若尚无工业化产品，可采用中试产品。

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