CRISPR技术在山羊和绵羊育种的研究进展
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2.3 CRISPR/Cas9 技术在改造羊乳研究中的应用 羊乳与人乳成分接近，是重要的牛乳补充替代品，尤其适合对牛乳过敏体质的人群，但羊乳含有β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）等致敏原，能引起人体过敏反应，因此在保证羊乳营养成分的同时去除其中的致敏成分成为提升羊乳品质的重要研究内容。 Zhou等成功利用CRISPR/Cas9系统生产了BLG基因敲除的山羊，在靶向敲除BLG基因的山羊乳腺组织中发现BLG表达量显著降低，相关乳蛋白编码基因也显著降低，羊奶中BLG蛋白也不表达。周文君等首次使用CRISPR/Cas9系统在山羊的BLG基因位点定点敲入人乳铁蛋白（hLF）的cDNA 序列，在保证羊乳营养价值的同时又减少了羊乳的过敏原性，还发现10 μmol/L 的RAD51蛋白激活剂（RS-1）可以显著提升Cas9引导的敲入效率 。此外，Teng等利用CRISPR/Cas9系统结合显微注射技术成功开发了一种可以生产富含褪黑素羊奶的绵羊生物反应器，这些基因编辑羊可能成为褪黑激素的良好来源。Huang等成功使用CRISPR/Cas9系统获得miR-145敲除的山羊乳腺上皮细胞，miR-145 敲除降低了TAG（Total Cellular Triacylglycerol）和胆固醇含量，并通过降低与脂肪酸合成相关的几个关键基因的表达进而影响脂肪酸组成。 3 CRISPR/Cas9 技术在其他动物育种研究中的应用 CRISPR/Cas 系统已经成功在猪上实现了多基因编辑、相关性状的遗传改良等，主要是作为模式动物进行相关研究并为人类疾病的研究提供了试验依据。Wang 等利用CRISPR/Cas9 和SCNT 有机结合获得了SIX1-/- 和SIX1-/- /SIX4-/- 的猪胚胎，其中SIX1-/-/SIX4-/- 型猪胚胎表现严重的肾脏发育迟缓。Xie 等利用CRISPR/Cas9 介导敲入靶向pRSAD2基因质粒，成功获得猪的pRSAD2-KI细胞；体外病毒激发试验显示，pRSAD2-KI细胞能够有效地降低猪瘟病毒和伪狂犬病病毒的感染；此外还利用SCNT 技术成功生产了1只pRSAD2-KI猪。 牛的基因编辑技术较其他物种发展较晚，迄今已开始在基础疾病相关基因功能研究、改善遗传特性、提升肉品质及生产药物蛋白等领域得到广泛应用。Zhou等利用截短的CRISPR/Cas9 gRNAs（1、2、3和5 bp）对牛胎儿成纤维细胞的MSTN 基因进行敲除，发现截短3 bp 的gRNA的CRISPR/Cas9-17质粒能有效降低脱靶效率且不降低牛MSTN基因打靶效率，丰富了CRISPR/Cas9 技术的编辑策略。Jeong等利用CRISPR/Cas9和SCNT技术结合将hFGF2基因导入牛成纤维细胞β-casein基因的内含子并获得了转hFGF2（Human Fibroblast Growth Factor 2）基因的囊胚，在细胞水平及胚胎水平成功检测到了hFGF2基因的表达。 禽类由于受精卵结构特殊，无法像哺乳动物那样直接通过核移植获得基因编辑个体，所以基因编辑技术在禽类上发展较为缓慢。Lee等使用CRISPR/Cas9系统和杂交技术成功获得了Z染色体敲除鸡，Z染色体编辑的鸡可以在胚胎发育过程中通过检测荧光进行性别鉴定。 4 存在问题及发展前景 CRISPR/Cas9作为当下最有效、最便捷的基因组编辑技术，已被应用于不同细胞及物种基因组的高精度改造和修饰，在建立动物模型和生物医学等方面有巨大潜力。但目前CRISPR/Cas9系统的脱靶效应和PAM 序列的局限性仍然是主要缺陷，所以未来的主要发展方向。仍然是降低脱靶效率，提升其特异性、精准性和稳定性。 此前有研究发现， 缩短sgRNA互补区域长度和增加PAM序列的长度均可以在保证目标基因组的编辑效率下显著降低脱靶率。此外，Kim等发现给sgRNA5'端添加2个鸟嘌呤也可显著增加其识别特异性并降低脱靶率。还有研究将腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)应用于CRISPR/Cas9系统，可显著促进其靶向能力并提高编辑效率。Timin等研究报道了由可降解聚合物微粒并经硅壳修饰的微载体可用于CRISPR/Cas9系统的传递，其转染效率还明显高于脂质体。如今的基因编辑技术已经进入精准编辑时代，脱靶效应和外源基因的定点插入效率等问题仍需要深入探索。此外，人们也在不断的优化和开发新的基因编辑技术以期应用于家畜育种、构建动物疾病模型和疾病治疗等各个领域。 综上所述，CRISPR/Cas系统具有巨大的发展空间和优化潜能，它的编辑效率高、构建简单、特异性强等的优势将有助于解决畜禽种业的瓶颈问题，使我国的种业得到快速、健康和持续发展。随着研究的逐步深入，CRISPR/Cas系统仍将不断完善和优化，争取在更多的领域获得成果。 |
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