CRISPR技术在山羊和绵羊育种的研究进展

摘要：规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat，CRISPR）及其相关蛋白（Cas）系统是一种新型的基因编辑技术，具有操作简单，编辑高效率等优点，在基因治疗、制作抗体药物、构建模式动物等领域广泛应用。山羊和绵羊作为重要的家畜类型，CRISPR/Cas9 基因编辑技术出现后，在山羊、绵羊的遗传修饰中得到迅速应用。本文概述了CRISPR/Cas 系统的发展历程、组成及分类、作用方式和原理，总结了CRISPR/Cas 系统近年来在提升山羊和绵羊生产性能方面的应用，并对该技术的发展前景作简要阐述，以期为解决畜禽种业的瓶颈问题以及我国畜禽种业的快速、健康和持续发展提供参考。

1 CRISPR 系统的发现与分类

CRISPR 系统是原核生物的一种抵抗外源基因入侵的获得性免疫系统，也是继ZFN 和TALEN 后第三代被广泛应用于基因组精准编辑的人工核酸酶技术。

1.1 CRISPR 系统的研究历史

1987 年，日本学家Ishino等首次在大肠杆菌的基因中发现特殊的串联间隔重复序列。之后对原核生物的基因组进行生物信息学分析发现，这种重复序列存在于50%的细菌和95%的古细菌中。直至2002 年，该基因家族被正式命名为CRISPR，并提出用Cas来命名相关核酸酶。2008 年，Marraffini等研究发现对应的Cas 蛋白主要作用于DNA序列，CRISPR可以破坏转染的外源质粒。2010 年，Garneau等研究发现Cas9是Cas蛋白中独特的基因簇，可以由酶介导对目标DNA 进行精准切割。2013年，Le等优化了CRISPR/Cas9系统，建立了一个由CRISPR，tracrRNA 和Cas9 组成的基因调控系统，并和Mali等首次利用CRISPR/Cas系统介导小鼠和人类的细胞进行基因编辑，成功定点修饰了哺乳动物基因组。这对CRISPR 系统来说具有里程碑式意义，为该技术在基因编辑领域的应用奠定了基础。此后，CRISPR/Cas9系统逐渐成为国内外研究人员青睐的工具，在生命科学各个领域的相关研究迅速增加。

1.2 CRISPR 系统的结构与类型

CRISPR/Cas系统是细菌为抵抗噬菌体而形成的一种免疫机制，它可以特异识别入侵的病毒序列并对外源入侵DNA 进行切割和降解。CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列，主要包括前导序列、CRISPR序列和Cas相关蛋白（图1）。

CRISPR 序列由重复序列（Repeats）和间隔序列（Spacer）相互交替排列组成，重复序列- 间隔序列的单元个数多变，在不同物种甚至同一物种中都可能不同。重复序列高度保守，间隔区间的回文序列可以形成发卡结构。间隔序列是被细菌俘获的外源DNA 序列，主要来自质粒和病毒。相邻的地方有一段保守序列，被称作原间隔序列临近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），该序列一般由NGG 3 个碱基组成（N代表任意碱基），在CRISPR/Cas系统中起到识别外源DNA 的重要作用。

Cas基因家族的种类繁多，编码的蛋白质具有与核苷酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等多种酶类结合的活性，其编码的蛋白都可以与CRISPR序列区域共同发生作用。

根据CRISPR RNA（crRNA） 成熟的方式及Cas蛋白的种类和功能的差异，可将CRISPR 系统分为两大类，进而分为6 种亚型（图2）。第一类为多种效应蛋白复合物组成的干扰靶基因的系统，包含I、III 和IV 型；第二类为单一效应蛋白组成的干扰靶基因的系统，包括II、V 和VI型。II型是最为典型、研究最为广泛的含有Cas9 基因的系统类型。其中Cas9蛋白具有核酸酶活性，并且在Cas基因附近有一段帮助crRNAs成熟的反式激活RNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）。Cas9与crRNA和tracrRNA结合，通过构象的变化暴露其核酸酶结构域，结合并切割靶序列，因此产生的双链断裂通常由同源导向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）进行修复。此外还有V型CRISPR/Cas12a（Cpf1）和VI型靶向RNA的CRISPR/Cas13等其他种类的Cas蛋白也逐渐被发现，进一步丰富了CRISPR/Cas系统。

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