猪肉中己烯雌酚残留检测方法

前    言
本标准按GB/T1.1—2000 《标准的结构和编写规则》进行编制
本标准附录是资料性附录
本标准由四川省畜牧食品局提出并归口
本标准由四川省质量技术监督局批准
本标准起草单位：四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所
本标准主要起草人：谢青、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚

猪肉中己烯雌酚残留检测方法－高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法
范围
本标准规定了猪肉中已烯雌酚残留检测的制样和高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）测定方法。
本标准适用于猪肉中己烯雌酚的残留量测定。检出限为0.5µg/kg。
规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)
GB/T 6682-1992  分析实验室用水规则和试验方法
农牧发[2003]1号  兽药残留试验技术规范（试行）
制样
样品的制备

取适量新鲜或冷冻的空白或供试猪肉组织，绞碎并使之均匀，密封。

样品的保存

-20℃以下冰箱中贮存备用。

测定方法

方法提要或原理

猪肉中的己烯雌酚用叔丁基甲基醚提取，正己烷脱脂，Oasis HLB固相萃取柱净化，氮气吹干。用高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。

试剂和材料

以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。  

己烯雌酚（DES） 含己烯雌酚(C₁₈H₂₀O₂)不得少于99%

叔丁基甲基醚  色谱纯

乙腈  色谱纯

甲醇  色谱纯

正己烷

氨水

己烯雌酚标准贮备溶液  取己烯雌酚标准品约10mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释成浓度为1mg/mL的标准贮备液，置-20℃保存，保存期不超过1年。

己烯雌酚标准溶液  准确量取己烯雌酚标准贮备溶液适量，用乙腈稀释成浓度为200ng/mL的标准溶液，置4℃冰箱中保存，保存期不超过1个月。

Waters Oasis^TM HLB 固相萃取柱或相当者  500mg，6mL。临用前分别用3mL叔丁基甲基醚、3mL甲醇和3mL水预处理，保持柱体湿润。

仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪或相当者（配电喷雾离子源）

天平  感量0.01g

分析天平 感量0.00001g

漩涡混合仪

振荡器

组织匀浆机

冷冻离心机

固相萃取装置

旋转蒸发仪

氮吹仪

微孔滤膜  0.22µm  

离心管  20mL 、50mL

测定步骤

试料的制备

试料的制备包括：

—— 取绞碎后的供试样品,作为供试试料。

—— 取绞碎后的空白样品,作为空白试料。

—— 取绞碎后空白样品,添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。

提取

 取10000r/min匀浆1min的试料（5±0.05）g，置50mL离心管中，加叔丁基甲基醚15mL，涡旋1min，振荡10min，在-4℃以6000r/min离心10min，将上层清夜移至鸡心瓶中。再加叔丁基甲基醚15mL同法操作，合并两次上清液，于45℃水浴中减压旋转蒸发至干。

净化

加80%乙腈溶液2mL于鸡心瓶中，旋涡溶解残留物，然后将其转移至10mL离心管中。加正己烷5mL于鸡心瓶中洗涤一并转移至鸡心瓶中，震荡混合1min，在15℃以6000 r/min离心10min，弃去上清液。再加正己烷5mL于离心管中同法操作，留下层备用。

取上述净化后的下层溶液，以每3～4秒1滴的流速通过预处理后的HLB固相萃取柱，先用甲醇：水（3+7）溶液3mL冲洗，然后加水3mL平衡，再用甲醇:2%氨水(1+9)溶液3mL冲洗，弃去洗液，抽干。用甲醇:叔丁基甲基醚(1+9)溶液7mL洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用80%乙腈1mL溶解残余物，充分涡旋，用0.22µm滤膜过滤，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

标准曲线的制备

精密量取己烯雌酚标准溶液，用乙腈稀释制得浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列标准工作溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

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