动物源性食品中细菌的检测——弯曲杆菌
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4.3 分子生物学方法 4.3.1 DNA探针检测方法 核酸（DNA）探针方法是一种非常重要的分子生物学方法，已广泛用于流行病学调查和临床诊断，此方法不仅敏感、特异，而且快速、经济。李广兴等应用地高辛标记核酸技术将地高辛结合到弯曲杆菌的基因组DNA上，制备了地高辛标记的DNA探针。该探针可特异地与空肠弯曲杆菌发生反应。具体操作步骤如下： （1）弯曲杆菌DNA的提取 取弯曲杆菌标准菌株培养物以TE缓冲液洗脱后，然后将菌体悬浮于TE缓冲液中，再于4℃下3500r/min离心15min，弃上清液，收集菌体并悬浮于适宜的TEＧ蔗糖缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为10mg/mL，37℃水浴振荡1h；加入十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度为1%，50～60℃振荡30min，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），振荡30min，5000g离心10min，吸取上层水相，用同样方法再抽提一次，用无水乙醇沉淀DNA，脱水干燥后溶于1mLTE缓冲液中，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，－20℃保存备用。 （2）核酸探针制备 取上述提取的弯曲杆菌DNA20μL加入1mL去离子水，超声波裂解处理，每隔2min取裂解样品10μL，常规琼脂糖凝胶电泳，选取电泳谱带较为集中且在05～1kb的裂解样品，经乙醇沉淀，脱水干燥后溶于去离子水中；然后按地高辛DNA标记和检测试剂盒说明进行核酸标记。 （3）DNA探针斑点印迹检测 包括点样、预杂交、杂交和杂交检测。 点样：取大小适度的硝酸纤维膜（NC膜），先用去离子水浸透，再置于20倍柠檬酸钠缓冲（SSC）溶液（3mol/L氯化钠，0.3mol/L柠檬酸钠）中浸泡30min，然后置于滤纸上，37℃温箱中烘干。取变性后的待检样品10μL点样于该NC膜上，室温干燥后再置80℃温箱中烘干固定2h。 预杂交和杂交：将点样膜装入20mL预杂交液（20倍SSC、0.1%十二烷基肌氨酸钠、0.02%SDS、1%封闭液）的塑料袋中，将袋封口，置68℃、转速为5r/min的转鼓内预杂交8h，倒掉预杂交液，加入杂交液（预杂交液中加入适当浓度的变性探针）置68℃杂交过夜。 杂交检测：取出杂交后的NC膜，用2倍SSC、0.1%SDS溶液，37℃洗膜2次，每次5min；用0.1倍SSC、0.1%SDS溶液，37℃洗膜2次，每次15min；接着在缓冲液Ⅰ（100mmol/L的Tris-盐酸、150mmol/L氯化钠，pH7.5）中短暂洗膜1次，然后封闭液37℃作用2h；用缓冲液Ⅰ短暂洗膜1次，再将NC膜放入缓冲液Ⅰ稀释的抗体结合物溶液（抗体浓度为75mU/mL）中作用1h；用缓冲液Ⅰ洗膜2次，每次15min；用缓冲液（100mmol/L的Tris-盐酸、100mmol/L氯化钠，50mmol/L氯化镁，pH9.5）洗涤2min，加入底物溶液（4μL/mL硝基蓝四氮唑、3.5μL/mL5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐）进行显色。当阳性对照点显示出颜色时，用TE缓冲液洗膜，终止反应。点样处出现紫蓝色为阳性杂交信号。 4.3.2 PCR 根据GenBank上公布的弯曲杆菌基因序列中的保守片段，应用Premier5.0软件设计和合成特异性引物。对被检样品进行增菌、纯培养处理，取纯培养菌株抽提DNA，制备DNA模板；按照常规PCR进行扩增，得到扩增序列后测序，与公布的序列进行同源性比对。 |