动物源性食品中细菌的检测——弯曲杆菌
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4.2 免疫学诊断方法 免疫学诊断是一种应用广泛且敏感性高的诊断方法，可应用于弯曲杆菌病诊断的方法主要有： 4.2.1 凝集试验 主要是检查被检样品中的抗体效价。将待检样品离心取上清液，并稀释成不同比例，向其内加入已知抗原，观察凝集效应，凝集效价达1∶100者，可判为阳性。但血清抗体效价较阴道黏液出现时间迟，其维持时间也不如后者长，故效果不如阴道黏液凝集试验满意。该方法主要应用于流产牛弯曲杆菌病的诊断。 4.2.2 间接荧光抗体法 用待检样品加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃孵育30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。再加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。具体步骤： （1）滴加0.01mol/L、pH7.4的PBS于已知抗原标本片上，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。 （2）滴加以0.01mol/L、pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷湿盒内，37℃保温30min。 （3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L、pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序过0.01mol/L、pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。 （4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加1滴一定稀释度的荧光标记的抗球蛋白抗体。 （5）将玻片平放在有盖搪瓷湿盒内，37℃保温30min。 （6）重复操作（3）。 （7）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加1滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。 （8）荧光显微镜高倍视野下观察。 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰： 标本自发荧光对照：标本加1～2滴0.01mol/L、pH7.4的PBS。 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 4.2.3 间接ELISA检测法 间接ELISA是ELISA的一种，是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。也有相关文献报道该方法可用于检测弯曲杆菌，具体步骤如下： （1）用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/mL，每孔加0.1mL，4℃过夜。次日洗涤3次。 （2）加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1mL于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1mL，37℃孵育30～60min，洗涤。 （3）加底物液显色 于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10～30min。 （4）终止反应 于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。 （5）结果判定 可于白色背景上直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”“－”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色剂显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍即为阳性。 |