动物源性食品中细菌的检测——弯曲杆菌
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在腹泻患者粪便中，该菌的分离率大大高于沙门氏菌。研究表明，该菌少至500个也可致病，但很少发生死亡，病死率为千分之一。最易感人群是5岁以下儿童和15～29岁的青年。 弯曲杆菌属特别是空肠弯曲杆菌是引起人类急性肠炎和腹泻的重要病原菌，对人类的健康构成了比较严重的威胁和危害。在2006年，弯曲杆菌病是欧盟报告最多的人的动物源性人畜共患病，共有175561例，比2005年有小幅度降低。弯曲杆菌是在新鲜的家禽肉中最常检出的细菌，平均有35%的样品呈现阳性。活家禽、猪和牛也常检出弯曲杆菌。 英国食品安全局于2010年7月27日发布了一份关于如何采取措施减少英国境内生鸡感染弯曲杆菌的报告，但由于弯曲杆菌所导致的食品安全事件仍有发生。英国食品安全局2016年年初公布报告，英国超市种购买的新鲜鸡肉七成可能携带空肠弯曲杆菌，每年感染约28万英国人。2006年5月，新西兰的人弯曲杆菌病流行达到顶峰。该年度报道发病率首次突破每10万人400例，是新西兰历史上最高的人弯曲杆菌病发病率。据估计，新西兰人弯曲杆菌病的流行每年至少造成1人死亡、800人住院，超过10万个社区发现该病病例，每年引起的经济损失达7500万美元。 4 检测方法 4.1 细菌分离鉴定 4.1.1 样品处理与增菌 4.1.1.1 碎牛肉 称取25g样品，置于均质杯内，加入100mL含有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的弯曲杆菌增菌肉汤，用均质器以8000～10000r/min均质30s。将均质液通过灭菌纱布，倒入一个容量为250mL的三角烧瓶中，置含有5%氧、85%氮、10%二氧化碳混合气体的微需氧条件下，42℃培养24～48h。 4.1.1.2 净膛全禽和分割禽肉 用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。取肉汤，经灭菌纱布过滤，于23000g、4℃离心20min，或于16300g、4℃离心30min，弃去上清液，将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的弯曲杆菌增菌肉汤中。培养方法同4.1.1.1。 4.1.1.3 牛奶 称取约40g牛奶放入离心管中，按4.1.1.2中的方法离心。弃去脂肪和上清液，将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的弯曲杆菌增菌肉汤中。培养方法同4.1.1.1。 4.1.1.4 贝类 将100g样品和100mL加有利福平、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐、多黏菌素、放线菌酮的抗生素溶液的增菌肉汤放入均质杯中，用均质器以8000～10000r/min转速均质30s。用灭菌纱布将上述均质液过滤。取50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中。培养方法同4.1.1.1。 4.1.1.5其他食品 所使用的增菌方法决定于食品的种类。虾、整尾海鱼和海鱼片经4.1.1.2处理后，用加有利福平、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐、多粘菌素、放线菌酮的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。羊肉和猪肉块可先用表面洗涤法处理，再用加有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的肉汤增菌。碎肉按4.1.1.1所列方法处理。液体食品按4.1.1.3所列方法处理。各种样品的培养方法均同4.1.1.1。 4.1.2 分离和初步鉴定 取5mL经24～48h增菌的培养物，以0.65μm孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的增菌培养物，分别在分离用改良Skirrow氏培养基平板上划线接种，将平板置以上微需氧条件下42℃培养24～48h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色（可能出现浅红色）凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片，用相差（或暗视野）显微镜检查。如果湿片镜检动力明显、呈快速的螺旋样运动，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，形状如小逗点状，两菌体的末端相接时呈S形、海鸥展翅形或螺旋状，可初步鉴定为弯曲杆菌。挑取初步鉴定为弯曲杆菌菌落，在布氏琼脂上划线做纯分离。培养方法同上。根据生化试验和抗生素敏感性试验进行菌株证实。 |