动物源性食品中细菌的检测——分枝杆菌属

（3）皮内注射比较试验结果判定 如果牛结核菌素反应阳性，且皮皱厚度比禽结核菌素反应大4mm以上，则认为是阳性反应；如果牛反应是阳性，并且牛反应的皮皱厚度仅比禽反应大1～4mm，则认为该反应不能定论。如果牛反应是阳性或阴性，但其反应等于或小于禽反应，认为该反应为阴性。这一判断方法在欧盟国家广泛使用。

（4）在尾槽测试中，标准的解释是任何摸到或可见的变化都被认为是阳性反应。另一种更改的方法也常常使用，这就是注射部位尾皱处的厚度与对照相比相差4mm以上，出现可摸到或可见的肿胀时判为阳性。另外，测试动物只要有一个尾皱的厚度达到8mm或8mm以上，则认为试验阳性。

4.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测乳中结核分枝杆菌抗体

牛乳中抗体检测已经用于布鲁氏菌病和白血病的诊断。有学者试图通过检测牛乳中结核分枝杆菌抗体，诊断牛患有结核病，同时评价牛乳的卫生安全。用牛分枝杆菌PPD作为包被抗原，脱脂乳（鲜牛乳4℃过夜，除去上层脂肪）为被检材料，兔抗牛IgG抗体为二抗，建立乳中牛分枝杆菌抗体的检测方法，但是由于和副结核分枝杆菌存在一定的交叉反应，只能用于牛乳中结核分枝杆菌污染的初步筛选。对于阳性样品还需要用其他方法验证。

4.6 荧光PCR法检测乳和乳制品中的结核分枝杆菌

（1）原理 乳及乳制品中结核分枝杆菌荧光PCR法是采用经典的TaqMan探针技术。根据牛分枝和人分枝杆菌的保守序列设计一对特异性引物及一条特异性荧光双标记探针，探针的5′端和3′端分别用FAM和TAMRA荧光素酶标记。当PCR反应退火时引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上报告荧光基团FAM发出的荧光信号被淬灭荧光基团TAMRA所吸收，仪器检测不到荧光基团FAM发出的荧光信号；当PCR反应进行延伸时，TaqDNA聚合酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链，当进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq DNA聚合酶发挥它的5′→3′外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸以便继续完成延伸过程，而FAM基团和TAMRA基团均游离在溶液中，仪器可检测到FAM基团发出的荧光信号。

（2）仪器与器材 荧光PCR检测仪、高速台式冷冻离心机、普通台式离心机、冰箱、涡旋振荡器、微量移液器、10mL离心管、15mL离心管等。

（3）检测引物和探针 上游引物：5′-GGTCGACACATAGGTGAGGTCT-3′。下游引物：5′-CGCTGATCCGGCCAC-3′。探针：FAM-CCGAAGCGGCGCTGGACGAG-TEMRA。扩增片段长度103bp。

（4）操作步骤

样品采集：用无菌注射器直接吸取鲜乳样品5～10mL置离心管中备用或者无菌采取25g乳粉放入无菌袋中备用。样品采集后4℃保存不超过24h，若长期保存需－20℃，且不能反复冻融。

鲜乳样品在混匀器中混匀后（或者无菌取乳粉样品5g放入灭菌烧杯中，加50mL生理盐水，剧烈振荡混匀），经4000r/min离心40min，弃上清液，加入5mL灭菌生理盐水重悬沉淀，定性滤纸过滤，滤液经4000r/min离心40min，弃上清液，加入500μL灭菌生理盐水重悬沉淀。

DNA提取：在样品中加入1.5mL4%的氢氧化钠溶液，37℃恒温处理30min或常温下处理1h，使其充分液化，若液化不完全，可适当再加入少量4%的氢氧化钠。将液化后的样品及阴性对照和阳性对照各500μL分别加入1.5mL无菌离心管中，1300r/min离心10min。弃上清液，用微量移液器尽量吸干液滴，沉淀中加入1mL灭菌生理盐水，振荡悬浮，1300r/min离心10min。弃上清液，加入1mL灭菌生理盐水，1300r/min离心10min。弃上清液，用0.5mL灭菌生理盐水重新悬浮沉淀，加12.5μL 20mg/mL的蛋白酶K和50μL的10%的SDS，55℃水浴30min。分别用Tris饱和酚、等体积酚和三氯甲烷各抽提一次。吸取上层水相，加1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃沉淀2h，4℃1300r/min离心10min。弃上清液，加入75%的乙醇，4℃1300r/min离心10min。弃上清液，晾干，加20μL TE缓冲液溶解，直接用于检测或－20℃保存备用。

样品的检测：PCR扩增反应体系25μL：10×PCR buffer（不含Mg2＋）25μL，MgSO4 0.5μL，dNTP2.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针1.0μL，ddH2O 7.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板10μL，所有成分加入荧光PCR管后，盖紧盖子，500r/min离心30s。荧光PCR检测仪循环程序：94℃，1min；95℃，5s，60℃，30s，40个循环。

单通道荧光PCR检测仪，无须选择检测通道；多通道荧光PCR检测仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，60℃收集荧光信号。

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