动物源性食品中寄生虫的检测——孟氏裂头蚴

5.1.2 屠宰后肉品检测

家畜屠宰后进行肉品检验，靠从局部检出虫体做出诊断。孟氏裂头蚴常迂回寄生，数量一般为1～7条，最多达数10条，也发现有成堆寄生的情况。多数寄生在皮下脂肪与肌肉间的疏松结缔组织、板脂、肠系膜中，肝脏等器官表面也有检出。同一宿主常见于虫体多部位寄生。也发现在背部、腹部、肩胛、胸部、臀部、横膈肌虫体寄生的组织。虫体为扁平带状乳白色，常见弯曲成团，如脂肪结节状，展开后如棉线样，位于腹膜下者常较舒展。虫体大小相差悬殊，虫体最长达10cm，最短的只有3.1cm，多数在30～80cm，虫体宽为0.01～0.5cm，虫体厚为0.1cm。在肝脏及腹内肌膜表面寄生的虫体较小，长度仅为3.1～6.2cm，呈白线头状。

5.2 血清学检测

孟氏裂头蚴侵入人体后主要引起皮肤或内脏幼虫移行症，这使该病的诊断具有明显的局限性，尤其是对于临床表现不明显的轻度感染、早期感染、隐性感染者诊断较为困难，需要综合血清抗体检测、流行病学资料、影像学检查结果才能做出正确的判断，其中抗体阳性是诊断和鉴别诊断的重要依据。人群中孟氏裂头蚴病患者常用影像学方法诊断，如CT、超声检查等技术；常用的免疫学诊断方法主要是ELISA、免疫印迹金标免疫渗滤法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）等。

5.2.1 ELISA

日本和韩国已应用ELISA检测血清特异性抗体辅助孟氏裂头蚴病诊断。在流行区，无任何症状的孟氏裂头蚴隐性感染者较为多见，血清抗体检测能够更好地反映流行情况。戚锡亮等用常规ELISA检测孟氏裂头蚴感染鼠和正常鼠血清中特异性抗体，结果显示敏感性和特异性均为100%，未见与血吸虫、蛔虫、短膜壳绦虫感染鼠血清有交叉反应。为了提高孟氏裂头蚴抗体检测的特异性，Kong等报道用单克隆抗体亲和层析纯化抗原，可大大提高免疫诊断的特异性。Ishii等用多种蠕虫抗原多点并列检测，根据其他蠕虫抗原与病人血清反应加以鉴别诊断。Yeo等应用裂头蚴单克隆抗体建立了竞争性ELISA检测病人血清中的特异性抗体，敏感性为94.1%（16/17），与常规ELISA相同；特异性为90.0%（45/50），略高于常规ELISA的86%（43/50）。Nishiyama等建立化学发光ELISA检测病人血清中特异性抗体，敏感性和特异性分别达到100%（14/14）和97.6%（41/42），与肥胖带绦虫、阔节裂头绦虫感染病人血清均无交叉反应。常规ELISA具体操作如下：

（1）手术切开纯种昆明小鼠腹部皮肤0.5cm，皮下腹膜外埋入活裂头蚴2条，缝合皮肤一针，45d后眼窝采血，置于微量离心管中，37℃温箱中存放2h，然后放入4℃冰箱中过夜，3500r/min离心20min，用滴管吸取上层免疫血清。

（2）抗原的制备 活的裂头蚴用消毒生理盐水冲洗3～4次，用匀浆器反复匀浆15min，按匀浆体积加入约10倍量0.01%硫柳汞生理盐水，反复冻融1周，加消毒玻璃珠振荡，超声粉碎10min，4℃以下10000r/min离心30min，吸取上清液，置－20℃保存备用。

（3）操作步骤 ①设空白对照管、阴性鼠对照管。阳性鼠管，每份标本做4孔测定，每孔加入裂头蚴抗原5μg/mL 100μL，放入4℃冰箱中过夜；②用PBS-吐温-20缓冲液冲洗孔3次，每次3min；③每孔加1∶40免疫血清100μL，放入4℃冰箱中过夜；④PBS-吐温-20缓冲液冲洗孔3次，每次3min；⑤每孔加酶标抗体100μL（浓度1∶20），放入37℃温箱中3～6h；⑥PBS-吐温-20冲洗3次，每次3min；⑦每孔加入酶底物100μL（现配），室温下放置20min；⑧每孔加入4mol/L硫酸50μL终止反应。⑨于酶联免疫检测仪450nm处读取OD值。感染鼠血清OD值超过阴性对照鼠血清OD均值2.1倍以上者，判为阳性。

5.2.2 免疫印记

免疫印迹检测对孟氏裂头蚴病的早期感染、深部组织寄生有较好的辅助针对效果。具体操作步骤如下：

（1）制备孟氏裂头蚴可溶性抗原 孟氏裂头蚴经生理盐水洗涤3次后用匀浆器反复匀浆15min，按匀浆体积加入约10倍量0.01%硫柳汞生理盐水，反复冻融1周，加消毒玻璃珠振荡，超声粉碎10min，4℃以下10000r/min离心30min，吸取上清液，置－20℃保存备用。

（2）制备孟氏裂头蚴感染兔血清 8条活孟氏裂头蚴经手术埋入兔双大腿内侧皮下，感染后每2周采血1次并分离血清。

（3）取待分离的抗原置SDS-PAGE（12.5%分离胶）胶槽中，在恒电流40mA条件下，电泳6h，然后将已分离好抗原蛋白的凝胶与NC膜相贴，置于转印装置中，经恒电流100mA转印11h。转印后，将被转印有抗原蛋白的NC膜用丽春红染色，证明蛋白分离和转印效果佳者供进一步做酶联免疫印迹（ELIB）用。ELIB反应条件：各种血清稀释度为1∶100，酶结合物用1∶30的HRPＧSPA，底物显色剂用DAB。具体步骤参考棘球蚴的免疫印迹检测方法。

Choi等研究发现以孟氏裂头蚴的粗提物为抗原进行血清学检测，与猪囊尾蚴、肺吸虫等多种寄生虫存在交叉反应，其中与肺吸虫的交叉反应率达80%（8/10），与囊尾蚴的交叉反应率为42.5%（17/40），这与所用的抗原为成分复杂的孟氏裂头蚴粗抗原有关。已有报道使用孟氏裂头蚴单克隆抗体亲和层析纯化抗原可大大提高孟氏裂头蚴病血清学诊断的特异性和敏感性。

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