农业农村部：兽用生物制品生产企业全面开展非瘟病毒核酸检测的公告

4.2.1.1.2扩增引物

primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；

primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。

4.2.1.1.3 DNA分子量标准品  DL500。

4.2.1.1.4  TAE电泳缓冲液  配制方法见《电泳液标准配制流程》。

4.2.1.1.5  1%琼脂糖凝胶板  在100 ml 1×TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，加热融化，加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0 mm左右。根据样品数量选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。

4.2.1.2 仪器  DNA扩增仪，稳压稳流电泳仪，水平电泳槽，凝胶成相系统（或紫外透射仪），微量移液器1套。

4.2.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、0.2ml薄壁PCR管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）。

4.2.2操作程序

4.2.2.1 样品DNA制备  按照前述方法进行核酸提取。

4.2.2.2 反应体系的配制  配制比样品数量至少多3个的反应体系，同时设立阳性和阴性对照。在阳性对照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 µl，在阴性对照反应管中加入2.0µl无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：

4.2.2.3  反应程序  将所有待检样品及阳性和阴性对照反应管放在PCR仪中，按照以下程序进行扩增：94℃2分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。4℃保存。

4.2.2.4  PCR扩增产物分析  取PCR扩增产物10 µl，加6×加样缓冲液2.0 µl，混匀，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V，电流50 mA，电泳时间30分钟。电泳结束后，用凝胶成像系统拍照，记录检测结果。

4.2.2.5 结果判定

4.2.2.5.1 质控标准

对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：

阴性对照应不出现257bp的特异性条带。

阳性对照应出现257bp的特异性条带。

4.2.2.5.2 判定

阳性：待检样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，扩增产物可通过DNA测序进一步确定基因型。

阴性：待检样品未出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

4.3  注意事项

4.3.1检测过程中应遵循PCR实验分区原则，即应区分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区。

4.3.2应避免在含有靶序列的区域中使用引物，防止污染靶序列。

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