农业农村部：兽用生物制品生产企业全面开展非瘟病毒核酸检测的公告

4.1.1.1.2 扩增引物及探针扩增引物：

ASF-05-Zsak-1466F（10µmol/L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'

ASF-05-Zsak-1528R（10µmol/L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'

探针ASF-05-Zsak-1486prob(10µmol/L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'

4.1.1.1.3 无核酸酶的灭菌水  PCR级别。

4.1.1.2  仪器  荧光定量PCR仪；微量移液器1套（最大量程分别为10µl、100 µl、200 µl、1000 µl）。

4.1.1.3 耗材  1.5ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）、一次性乳胶手套。

4.1.2  操作程序

4.1.2.1 样品DNA制备  按照前述方法进行核酸提取。

4.1.2.2 反应体系的配制  配制比样品数量至少多4个的反应体系，同时设置强阳性、弱阳性和阴性对照。在强阳性和弱阳性对照反应管中分别加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3 µl，在阴性对照反应管中加入3µl无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：

4.1.2.3  反应程序  将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性对照反应管放在荧光定量PCR仪中，按照以下程序进行扩增：50℃2分钟，95℃5分钟，95℃15秒，58℃退火延伸1分钟，45个循环（荧光信号收集在此阶段每次循环的退火延伸时进行）。

4.1.2.4  结果判定

4.1.2.4.1 阈值设定  试验操作结束后，确定Ct值。Ct值为每个样品反应管内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。

4.1.2.4.2 质控标准

对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：

阴性对照无Ct 值，且无扩增曲线。

强阳性对照的Ct 值应在18～22之间，并出现典型的扩增曲线。弱阳性对照的Ct 值应在33～35之间，并出现典型的扩增曲线。

4.1.2.4.3 判定

阴性：无Ct值，且未出现扩增曲线，判定为样品中无ASFV核酸。

阳性：Ct值≤40，且出现典型的扩增曲线，判定为样品中存在ASFV核酸。

可疑：Ct值>40，且出现典型扩增曲线，判定为可疑，应重检。重检后，Ct值≤40且出现典型扩增曲线者判为阳性，其他情况均判定为阴性。

4.2  普通 PCR检测法

4.2.1  试剂和器材

4.2.1.1  试剂

4.2.1.1.1 PCR试剂  10×PCR缓冲液（含25 mmol/l  Mg2+），DNA扩增酶，dNTP预混液。

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