农业农村部：兽用生物制品生产企业全面开展非瘟病毒核酸检测的公告

2.2 其他生物制品和半成品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。

2.3 猪源毒种  取至少2支毒种。冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。

2.4 猪源细胞  除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。

2.5 其他猪源原辅材料

2.5.1猪组织  每种组织，分别取样和处理。取不少于2.0 g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟，4℃下以2000～3000 g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。

2.5.2猪血清  每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。

2.5.3猪胰酶  干粉状胰酶，取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。

2.5.4其他猪源衍生物  固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。

3  核酸提取

3.1 试剂和器材

3.1.1试剂  根据核酸提取方法确定，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。

3.1.2仪器  核酸含量测定仪；常温台式离心机；旋涡振荡器；水浴锅；微量移液器1套（最大量程分别为10 µl、100 µl、200 µl、1000 µl）。

3.1.3耗材  1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10 µl、0～200 µl、100～1000 µl）、一次性乳胶手套。

3.2  操作程序（TRIZOL法），也可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。

3.2.1取样品250 µl，加入750 µlTrizol，颠倒混匀，室温放置5分钟。

3.2.2加入200 µl氯仿，充分混匀，室温放置10 分钟，4℃下以12000 g离心15 分钟。

3.2.3弃去上清液，加入220 µl无水乙醇，颠倒混合，15～30℃放置2～3分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟，沉淀物为DNA。

3.2.4弃去上清液，加入含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 µl洗涤DNA，15～30℃放置30分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟。重复一次。

3.2.5加入75%乙醇1.2 ml，重悬DNA沉淀，15～30℃放置20分钟，4℃2000 g离心5分钟。可重复一次，充分洗涤DNA沉淀。

3.2.6弃去上清液，敞开离心管管口，在空气中干燥5～10分钟，加入30～50 μl的无核酸酶灭菌水溶解DNA，－20℃以下保存备用。

3.3  注意事项

3.3.1核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力，应做好个人防护，佩戴手套、口罩和护目镜，防止液体飞溅到皮肤和眼睛。

3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，要防止样品之间相互污染，最好使用带滤芯的枪头，且每次吸取取液体时均需更换枪头。

3.3.3为防止核苷酸降解，应避免核酸酶污染，使用的耗材均需无核酸酶。

3.3.4做好剩余样品的无害化处理及操作台面的消毒处理。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处理，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用1%卫可擦拭。

3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，防止污染。

4  检测

下列两种方法可任选其一。

4.1  实时荧光定量PCR检测法

4.1.1试剂和器材

4.1.1.1 试剂

4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂  本操作中以AppliedBiosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为例，也可选用其他荧光定量PCR试剂。

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