口蹄疫等动物疫病诊断技术研究进展

3.准备区。( 1)戴手套;(2)含反应混合液的离心管在解冻前都应快速离心数秒;(3)工作结束后，必须立即对工作区进行清洁，实验台面紫外照射半个小时以上;(4)实验室及设备的使用必须要有日常记录。

4.样本处理区。(1)要正确使用加样器;(2)为避免样本间污染，最好不要同时打开多个样本;(3)对具有潜在污染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序;(4)用过的加样器枪头必须放人专门的消毒容器中。

5.核酸提取区。(1) RNA标本使用的枪头离心管必须无菌且RNA-free ; (2)工作台面必须洁净。用过的加样器枪头必须放人专门的消毒容器中;(3)实验结束及时进行清洁。

6.扩增区。(1)将制备好的核酸加人反应混合液;(2)将阳性对照加人反应混合液;(3)需在超净台进行;(4)加好所有样品之后应快速离心数秒;(5)整个PCR过程在冰上操作;(6)混合体系加好后必须立即上机，不能放置。

(二)PCR污染与对策

1.污染的预防。(1) PCR的前处理与后处理要在不同的隔离工作台上或房间内进行;(2)分装试剂，标记批号;(3)改进实验操作，带一次性手套、枪头，枪头不要暴露于空气;避免反应液的飞溅;操作多份样品时，要先将可混匀的成分一起制备成混合液;最后加人样品，并且在加人每一管核酸后，立即盖紧管盖;(4)检查结果的可重复性。

2.污染源的追踪。常见的环境污染源有:加样器、清洁用具、离心机、枪尖、离心管、冰箱门把手。

3.污染源的处理。(1)化学处理法:实验易污染的部位或器械可用lmol/L  HCL擦拭核酸降解液(随时随地);(2)紫外法:紫外线照射对于长片段(SOObp以上)有效，而对短片段效果不大。

4.因操作欠规范导致的问题分析。(1)仪器使用不当引起的污染问题:①离心机:必须配平;②移液器:严禁大力来回拧动，严禁调至容量之外使用，枪头应浸人液面2一3 mm处吸取，严禁将有液体的移液器平放或倒置，每周用75%乙醇清洗一次;(2)实验室布局不合理引起的污染问题:①样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片段均会通过空气进行传播;②仪器设备及工作服等(尤其是加样器)公用，造成严重污染;③实验室操作垃圾乱放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室污染。

(三)血清学方法检测结果的影响因素

1.试剂因素。试剂质量是影响检测结果的直接因素，其抗原抗体的纯度，标准品定值的准确性，抗体的亲和力、滴度和特异性，标记物的比活性或免疫活性等。均对测定结果产生直接影响。还有试剂盒的稳定有效期，运输条件及储存方式等也均会对结果产生一定程度的影响。

2.标本因素。(I)内源性因素:ELISA检测中会出现HOOK效应，主要是由抗原或抗体过量引起，在一步法反应中频繁出现。固相竞争ELISA克服了这种缺陷，但在检测猪血清过程中仍偶尔出现钩状结果，易出现假阴性结果。这是由于血清中内源性因子非特异性结合引起的，通过高倍稀释或加人百分之五的异源血清可以缓解内源性因子的干扰;(2)外源性因素:包括标本溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全和添加剂的干扰作用等。

3.实验原理或操作方法。ELISA试剂盒操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。ELISA试剂盒操作大体分为四部分，以下叙述各个步骤中的影响因素。

(1)加样操作的影响：加样速度适中，避免加样于孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快或太慢，无法保证微量加样的准确性和均一性;加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附;溅出会对邻近孔产生污染;出现气泡则反应液界面有差异;

(2)温育的影响：温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2℃—8℃温育时间不够，弱阳性标本检测不出;温育温度不够，弱阳性标本也难以检出;

(3)洗板的影响：在ELISA操作中，洗板是关键步骤之一，可除去样液中非特异性吸附在固相载体上的干扰物、游离的抗体和酶标记物，保证反应的定量关系，洗涤不充分直接影响检测结果的准确性、重复性，甚至“花板”导致整个试验失败。因此洗板次数、注水量应符合要求，洗板方法也要正确，洗板次数也并非越多越好，拍板用的纸重复使用也可能造成污染。洗板次数较少，造成残留，可引起假阳性结果;洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阳性结果。

(4)显色的影响：影响显色的关键是显色温度和显色时间，显色时间过长或过短均会造成弱阳性标本不能显色而导致假阴性发生。ELISA实验终止液反应后依然会引起颜色的持续变化，影响阴性和弱阳性样品及定量检测样品的结果，特别在大批样品需较长时间进行读数时，这种潜在的颜色逐渐变化现象成为结果影响的重要因素。

4.环境因素。( 1)通风、采光与防尘;(2)环境温度与湿度随地理位置不同可有很大差异应使用系统空调进行控温，并要求控制空气湿度为40%一70%之间;(3)稳定水电，实验过程中应采用蒸馏水(纯水)或经软化处理的自来水。

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