副猪嗜血杆菌与猪链球菌混合感染案例分析（图）

2.2.2 细菌分离培养

首先配制TSA平板（加有5%胎牛血清和1% NAD），将剪取的病变组织涂抹于TSA平板和血平板上，用接种环划线后置于37 ℃培养箱培养24 ~ 48 h，观察菌落形态，并挑取单菌落进行纯化培养。

2.2.3 革兰氏染色镜检

挑取纯化培养后的单菌落涂片，将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗；滴加革兰氏碘液，1 min，水洗；滴加脱色酒精，约30 s；水洗后滴加沙黄复染液，复染1 min，水洗，待干，显微镜下观察细菌的形态特点。

2.2.4 药敏试验

挑取纯化培养的单个菌落加入500 μL的无菌培养基中37 ℃摇至培养基浑浊，离心后吸去部分上层液，取200 μL菌液至TSA平板中，用玻璃棒涂抹均匀，随后贴上各种药敏纸片，37 ℃培养24 ~ 48h，用直尺测量抑菌圈的直径，依据药品说明书判定结果（表2）。

表2 药敏实验判定标准

3、结果

3.1 病料的PCR鉴定

由PCR电泳图可知，用猪繁殖与呼吸综合征病毒套式PCR引物在发病仔猪解剖后的淋巴结、肺均未扩增出914 bp阳性条带，提示未检测到蓝耳抗原（图2）；用副猪嗜血杆菌PCR套式引物在发病仔猪解剖后的肺、心包液、腹股沟淋巴结及肿胀关节液等样品中扩增出197 bp阳性条带，提示检测到副猪嗜血杆菌抗原（图3）；用猪链球菌PCR引物在发病仔猪解剖后关节脓性渗出物、腹股沟淋巴结及肿胀关节液扩增出207 bp阳性条带，提示检测到链球菌抗原（图4）。

图2 猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR鉴定结果。M：DNA分子Marker；“+”表示阳性对照，“－”表示阴性对照；

图3 副猪嗜血杆菌PCR鉴定结果。M：DNA分子Marker；“－”表示阴性对照；