兽医图谱

副猪嗜血杆菌与猪链球菌混合感染案例分析(图)

日期:08-06 作者:郭春和、朱振邦等- 小 + 大

表1 猪链球菌及副猪嗜血杆菌引物设计

2.2.1.2 PCR模板

病料DNA/RNA提取:剪取病变明显的部位,放入装有磁珠的EP管中,加入500 μL的PBS,组织破碎仪将组织磨碎,之后按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书进行基因组提取:用接种环勾取单个纯化培养后的菌落,加入到500 μL的液体培养基中,37 ℃摇菌过夜,以此作为PCR反应的模板。同时做阳性对照及阴性对照。

2.2.1.3 PCR反应体系及反应条件

猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR反应体系:病毒RNA的反转(10 μL):RNA模板2 μL ,5×Buffer 2 μL,反转引物(GP5-R1) 0.5 μL,dNTP 0.5 μL,RNase inhibitor 0.25 μL,RTass M-MLV 0.5 μL,ddH2O 4.25 μL;一次PCR体系(20 μL):反转cDNA 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下游引物(GP5-F1/R1)各1 μL,ddH2O 6 μL;二次PCR反应体系(20 μL):第一次PCR产物 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下游引物(GP5-F2/R2)各1 μL,ddH2O 7 μL。

猪繁殖与呼吸综合征病毒套式PCR反应条件为94 ℃预变性2 min;一次PCR 94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸55 s,30个循环;二次PCR 94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸55 s,30个循环;72 ℃再延伸5 min。

副猪嗜血杆菌套式PCR反应体系:一次PCR体系(20 μL):菌体(病料)DNA 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下游引物(HPS-Outer-F/R)各1 μL,ddH2O 6 μL;二次PCR反应体系(20 μL):第一次PCR产物 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下游引物(HPS-Inner-F/R)各1 μL,ddH20 7 μL。

副猪嗜血杆菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min;一次PCR 94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,30个循环;二次PCR 94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,30个循环;72 ℃再延伸5 min。

猪链球菌PCR反应体系(20 μL):菌体(病料)DNA 2 μL,2×Taq PCR StarMix 10 μL,上、下游引物(SS-F/R)各1 μL,ddH2O 6 μL。

猪链球菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,30个循环;72 ℃再延伸5 min。

经5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。

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