兽医战略
牛传染性鼻气管炎诊断技术研究进展
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（二）ELISA ELISA法是将酶与抗原结合成酶标记物，这些酶标记物仍保持原有的免疫学活性和酶的活性，它可与吸附在固相载体上的抗体发生特异性结合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体量呈正比，此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定。ELISA法因其具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，在大批量动物进口时作为首选方法被推广使用，但经长期应用发现，目前市场上已商品化的ELISA试剂盒或多或少存在有质量问题，出现假阳性或假阴性的几率较大，很难确保检疫质量，而且进口的试剂盒价格普遍偏高，无形中又增加了检疫的成本。 （三）琼脂扩散试验 可用已知的IBR抗原检查被检血清中的沉淀抗体，也可用IBR阳性血清来检测病料标本或细胞培养物中的相应抗原。 （四）间接血凝试验 将已知抗原结合在鞣酸处理的绵羊红细胞上，采用常规的试管凝集法或微量凝集法来检查被检测血清中的相应抗体，这是一种简便、快速、实用的诊断方法。由于IBRV有潜伏感染性，自然感染病牛中和抗体滴度在感染2周时才达到高峰，并且在持续2周或4周后即逐渐下降，且可能降到零，进入潜伏感染期。此后，一旦应激因素刺激，抗体滴度又上升，并排毒，如此反复，IBR感染牛的抗体滴度也随之呈现波浪式的起伏。因此，即便通过中和试验或ELISA法判定牛群IBR抗体呈阴性反应，仍难保证牛群确无IBRV感染。由此可认为，要确定1个牛群是否有IBRV感染的最根本的方法应当是检测IBR抗原。 （五）病毒分离鉴定 1.样品的收集和处理：从早期感染牛采集鼻腔拭子。对于外阴道炎和**炎病例，采取生殖道拭子，用拭子在生殖道阴道黏膜表面上用力刮取，**可用生理盐水冲洗包皮，收集其洗液。所有样品均应悬浮于运输培养基（含抗生素和2％犊牛血清的组织培养液），储存于4℃，并迅速送达实验室。样品送到实验室后，将拭子在运输培养基中充分搅动以便将病毒洗脱，室温放置30 min再取出拭子，将运输液1500 r/min离心10 min，取上清液用作病毒分离的样品。用做病毒分离的精液需经特殊处理，因为精液中含有对细胞有毒或对病毒增殖有抑制作用的酶和其它因子。 2.病毒分离：多种细胞可用于IBRV分离，牛胎儿肺、鼻甲或气管等组织制备的细胞株及已建立的传代细胞系（如MDBK细胞）都比较合适。当使用24孔塑料培养板时，每孔需接种细胞培养物上清液100 μl～200 μl，吸附1h后倾去液体，然后，加入维持液。每天观察细胞病变情况，一般于接种后3 d出现细胞病变现象（CPE）。细胞的典型变化是圆缩，聚集成葡萄样群落，在单层细胞上形成空洞，有时会发现有数个细胞核的巨大细胞。若7 d还不出现CPE，应再盲传1次，将培养物经反复冻溶后离心，取其上清液用于接种新的单层细胞做进一步病毒分离。为鉴定致细胞病变的病毒是否为IBRV，细胞培养的上清液必须与单特异IBRV抗血清或单克隆抗体(MAb)作中和试验。 （六）免疫荧光试验 用来检查眼结膜触片、组织切片和细胞培养物涂片中的IBRV。 （七）PCR法 1993年，Vilcek将聚合酶链式反应(PCR)方法用于IBR的诊断。试验证明，PCR比病毒分离更加敏感，阳性检出率比病毒分离高出5倍。甚至可检出3个分子的病毒。由于其具有很高的灵敏度而能够在检测牛血清中微量的IBRV等方面得到重要应用。因此，将PCR技术应用到进出境牛的传染性鼻气管炎病毒的检疫，将会大大降低检疫成本和检疫周期，并有效的提高检出率，为打破贸易技术壁垒、促进我国外贸事业的进一步发展，保护我国畜牧业生产的安全发挥出极大的作用。 |
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