兽医战略
牛羊赤羽病研究进展
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6.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) 日本的IdeS等[12]首次建立了检测牛血清中AKV抗体的ELISA方法；李健等[13]应用纯化的细胞毒在国内首次建立了间接ELISA试验，该方法快速，待检样品不需灭活，其特异性和敏感性均高于血清中和试验。花群义等[14]应用重组N基因表达的核蛋白抗原建立了间接ELISA试验，用重组核蛋白(N)抗原代替完整病毒作为ELISA检测用的标准抗原，克服了用全病毒所带来的生物安全隐患。该法已经作为我国进口种畜AKV的检测方法。鱼海琼等[15]用AKV的单克隆抗体建立了阻断ELISA检测赤羽病病毒血清抗体。TsudaT等[16]用AKV的中和单抗通过竞争ELISA检测牛血清中的AKV抗体。286份牛血清先用血清中和试验检测，再用竞争ELISA检测，竞争ELISA的相对特异性高于98%，而单个单抗的相对敏感性在49%～82.2%之间，表明竞争ELISA可作为检测AKV抗体的快速和特异性方法，且有可能替代血清中和试验。 6.2.5 间接荧光抗体法(IFNT) 李少英等[17]以兔抗赤羽病重组核蛋白血清作一抗，利用间接荧光抗体法在AKV感染的BHK21培养细胞和攻毒的乳鼠组织中检测到AKV抗原，此法特异性高且操作时间短。 6.3 分子生物学诊断 李健等[18]根据AKV的SRNA序列，设计合成3对引物，在国内第一次建立了检测AKV的RTPCR方法，能够敏感的检测出阳性样品。StramY等[19]从以色列中部的Volcan的库蠓中用荧光PCR检测到该病毒的S RNA片断，这也是第一次应用荧光定量PCR技术检测此病。 6.4 鉴别诊断 AKV与Aino病毒的SRNA的同源性高达73.5%,5′端非编码区的RNA序列同源性为55%，因此在对阿卡班的诊断时要注意与Aino病毒的非特异性反应。 StuartD等[20]选择Aino病毒制备单抗，筛选出一株能与辛布血清群所有病毒反应的群特异性单克隆抗体，作为群特异性间接ELISA的检测抗体，可对5种辛布血清群病毒(Akabane，Tinaroo，Peaton，Douglas，Aino)先进行血清群鉴定，再用这5种病毒分别制备多克隆抗体，作为型间接ELISA的检测抗体，可分别鉴别这5种病毒。此法能较为准确的检测辛布血清群的各种病毒。 Akashi H等[21]针对AKV和Aino病毒的SRNA给每个病毒各设计了两对病毒特异性引物，先进行病毒基因组的反转录，提纯后作为模板用特异性引物进行套式PCR。应用此方法，在被感染细胞的上清液中，Anio病毒的最低检测浓度达到10－3蚀斑形成单位，AKV的最低检测浓度达到10－5蚀斑形成单位。 Stram Y等[22]用Taqman探针以多重反转录荧光PCR法检测AKV和Aino病毒。SRNA序列经比对后设计引物和探针，确保AKV引物和探针只识别AKV而不识别Aino病毒，反之亦然。用VIC标记AKV的探针，FAM标记Aino的探针。以cDNA10倍系列稀释作为标准品绘制标准曲线对未知病毒样品进行定量。此法能检测到约3个～30个拷贝的病毒S RNA。 7 防控 Levin A等[23]比对了所有发表的SRNA序列后，选择两个同源性为100%的保守区域为靶序列设计了2个siRNA，第3个siRNA是针对两株澳大利亚分离株上只相差1个碱基的保守区域而设计的。单个siRNA分别转染细胞后对AKV的复制有99%的抑制作用，当同时把3个siRNA转染入细胞时，其抑制性可达100%。该研究表明，有望用siRNA控制赤羽病。 最可靠的预防方法是在流行期之前对妊娠家畜及预定配种的家畜进行赤羽病疫苗接种，可获得充分的免疫力。目前所用疫苗有活苗和灭活苗两种，活苗为30℃下，在Hmlu1细胞上致弱的弱毒疫苗，给牛免疫接种；灭活苗为OBE1灭活氢氧化铝苗，给牛注射2次，间隔4周，每次3mL，具有良好的保护作用。犊牛和妊娠羊在如上接种以后，用强毒进行攻击，不发生病毒血症和胎儿感染。 8 结语 赤羽病是家畜疾病中传染率及发病率很高的一种疾病，且由于感染动物一般不出现临床症状，不易在感染早期发现，该病在我国广泛存在，一旦暴发将给我国畜牧业造成严重的经济损失。虽然利用siRNA可以抑制AKV的复制，有望由此来治疗此病，但成本太高，所以应用快速准确的方法检测阿卡班病毒并防止其传播是极为重要的。加强进出口检疫防止病原传入，改善环境卫生，消灭吸血昆虫，制定计划定期进行疫苗接种，是预防本病的三项有效措施。 参考文献（略） |
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