5、试验方法
攻毒预试验
先将保存的鸡大肠杆菌O1型菌株接种到血琼脂平板，再挑选典型菌落接种于肉汤中，将分离纯化后的肉汤培养液作为攻毒菌。
随机选取90只15日龄伊莎褐蛋鸡，分为18组，分别以原细菌培养液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释液为攻毒液，胸部肌肉注射攻毒，每个稀释度分1m1、0.5m1、0.25m1三个剂量，接种后观察各组试验鸡的精神、采食、饮水、粪便、呼吸等临床情况；对死亡鸡进行病理剖检，取肝脏做细菌分离培养。观察48小时，记录死亡情况。以半数致死量作为攻毒剂量。
治疗试验
试验动物分组和处理 将300只雏鸡随机分为6组，每组50羽，待稳定后进行试验。根据预试验结果确定攻毒菌液稀释浓度和剂量，除阴性对照组外，每组鸡胸肌注射该剂量的鸡大肠杆菌O1菌液。攻毒后，观察各阳性对照组鸡的精神、采食、饮水、呼吸、粪便等临床表现，待出现典型湿热泄泻症候（精神萎靡不振，羽毛蓬乱，离群呆立，食欲废绝，腹泻，粪便呈黄绿色水便）时开始混饮用药。其中第1～3组用连芩止泻口服液治疗，分别以高剂量（第1组，1.5ml/kg体重）、中剂量（第2组，1.0ml/kg体重）和低剂量（第3组，0.5ml/kg体重）饮水给药；第4组为药物对照组，用氟苯尼考可溶性粉（20mg/kg体重）混饮；第5组为阳性对照组，攻毒不给药；第6组为阴性对照组，不攻毒不给药。药物治疗组连续用药5天，各组存活鸡第7天全部扑杀。试验动物分组及处理见表1。
表1 试验动物分组及处理
| 组别 | 羽数/组 | 接种方法 | 接种
菌量 | 药物 | 剂量 | 给药
方法 | | 1组（连葛高剂量组） | 50 | 胸肌注射 | 0.5mL | 连葛口服液 | 1.5mL/kg | 混饮 | | 2组（连葛中剂量组） | 50 | 胸肌注射 | 0.5mL | 连葛口服液 | 1.0mL/kg | 混饮 | | 3组（连葛低剂量组） | 50 | 胸肌注射 | 0.5mL | 连葛口服液 | 0.5mL/kg | 混饮 | | 4组（氟苯尼考组） | 50 | 胸肌注射 | 0.5mL | 氟苯尼考可溶性粉 | 20mg/kg | 混饮 | | 5组（阳性对照组） | 50 | 胸肌注射 | 0.5mL | － | － | － | | 6组（阴性对照组） | 50 | － | － | － | － | － |
试验期间每天定时观察并记录试验鸡的临床症状变化、死亡、增重情况，对死鸡作病理剖检和细菌分离、生化鉴定、O抗原测定。计算各组的保护率、治愈率、死亡率，于接种细菌前和试验结束时分别称量各组鸡的体重，计算相对增重率，并对各组间的上述指标进行统计学分析。
疗效评价指标
死亡率：凡在试验期间，出现鸡大肠杆菌病的典型湿热泄泻证（精神萎靡不振，羽毛蓬乱，离群呆立，食欲废绝，粪便呈黄绿色水便，少数粪便带血）并死亡；尸体剖检心脏、肝脏等有典型病变特征；并从肝脏、脾脏及肠系膜淋巴结中分离出大肠杆菌，判为死亡，试验结束时每组死亡鸡只数占该组试验鸡数的百分率为死亡率；
保护率：经用药后，湿热泄泻症侯有所缓解或痊愈均为保护，试验结束时每组存活鸡只数占该组试验鸡数的百分率为保护率；
治愈率：在试验期间，鸡经混饮给药后，精神状态、食欲、饮水恢复正常，体重增加，不再出现腹泻等临床症状，剖检无任何病变属治愈。试验结束时每组治愈鸡只数占该组试验鸡数的百分率为治愈率；
相对增重率：试验期间各试验组增重占阴性对照组增重的百分比。阴性对照组增重设为100%。
数据的分析和处理
对试验数据进行显著性检验，其中死亡率、保护率及治愈率用x2检验；增重采用t检验。
（二）结果
1、攻毒预试验
人工感染大肠杆菌约8小时后，各试验组鸡均出现不同程度的鸡大肠杆菌病典型症状：精神不振、腹泻、眼结膜潮红、食欲减退至废绝等。12小时后开始出现死亡，从病死鸡肝脏可分离到细菌，经生化鉴定为大肠杆菌。攻毒鸡的死亡情况见表2。
表2 不同剂量、不同稀释度攻毒死亡鸡只数
死亡数
剂量 | 原液 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 1mL | 5 | 5 | 5 | 5 | 4 | 2 | 0.5mL | 5 | 5 | 5 | 4 | 3 | 2 | 0.25mL | 5 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 |
为了更好的评价药物对鸡大肠杆菌病的预防效果，故在建立动物疾病模型时应选择适当的攻毒液浓度和用量，尽量达到动物发病但不死亡的理想效果。本试验选择半数致死量作为攻毒的最佳剂量。根据试验结果，选用攻毒浓度为细菌培养液10-4稀释液，剂量为0.5mL/只。
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