规范标准

J亚群禽白血病防治技术规范

日期:03-21 作者:佚名- 小 + 大

    5 预防与控制预防与控制预防与控制预防与控制 实行净化种群为主的综合性防治措施。
    5.1 加强饲养管理,提高环境控制水平 饲养、生产、经营等场所必须符合《动物防疫条件审核管理办法》(农业部15号令)的要求,并须取得动物防疫合格证。 
    饲养场实行全进全出饲养方式,控制人员出入,严格执行清洁和消毒程序。
    5.2 加强消毒管理,做好基础防疫工作 各饲养场、屠宰厂(场)、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生(消毒)管理制度。
    5.3 监测 养禽场应做好死亡鸡肿瘤发生情况的记录,并接受动物防疫监督机构监督。
    5.4 引种检疫 国内异地引入种禽时,应经引入地动物防疫监督机构审核批准,并取得原产地动物防疫监督机构出具的无J-亚群禽白血病证明和检疫合格证明。 

    附件1 J----亚群禽白血病病原分离
    1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备
    取10~12日龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF,置于35㎜~60㎜平皿或小方瓶中。待细胞单层形成后,减少维持用培养液中的血清至1%左右。 
    2 病料的处理和接种
    2.1 血清或血浆样品:从疑似病鸡无菌采血分离血清或血浆,于35㎜~60㎜带CEF的平皿或小方瓶中加入0.2mL~0.5mL血清或血浆样品。 肝、脾、肾组织样品:取一定量(1~2克)组织研磨成匀浆后,按1:1加入无菌的PBS,置于1.5 mL离心管中10000g离心20分钟,用无菌吸头取出上清液,移入另一无菌离心管中,再于10000g离心20分钟,按10000IU/ mL量加入青霉素后,在带有CEF的平皿或小方瓶中接种0.2mL~0.5mL。
    2.2 接种后浆平皿或小方瓶置于37℃中培养3小时后,重新更换培养液,继续培养7天,其间应更换1次培养液。 2.3 以常规方法,用胰酶溶液将感染的CEF单层消化后,再作为第2代细胞接种于另一块带有3~4片载玻片的35㎜~60㎜平皿中,继续培养7天。 
    3 病毒的检测
    用以下方法之一检测病毒。
    3.1 IFA:将带有感染的CEF的载玻片取出,用丙酮-乙醇(7:3)混合液固定后,用ALV-J单克隆抗体或单因子血清及FITC标记的抗小鼠或抗鸡Ig标记抗体按通常的方法做间接荧光试验。在荧光显微镜下观察有关呈病毒特异性荧光的细胞。
    3.2 PCR:从CEF悬液提取基因组DNA作为模板,以已发表的ALV-J特异性引物为引物,直接测序;或克隆后提取原核测序,将测序结果与已发表的ALV-J原型株比较,基因序列同源性应在85%以上。
    注意:由于内源性ALV的干扰作用,按严格要求,病毒应接种在对内源性ALV有抵抗作用的CEF/E品系鸡来源的细胞或细胞系(如DF1)。但我国多数实验室无法做到这点,在结果判定时会有一点风险。如果3.1、3.2都做了,相互验证,可以大大减少风险。
    附件2 J----亚群禽白血病酶联免疫吸附试验(ELISA)
    本方法可检测鸡血清中J-亚群禽白血病病毒抗体。适用于J-亚群禽白血病病毒水平感染的群体普查。
    1 样品准备
     检测之前要用样品稀释液将被检样品进行500倍稀释(如:1μL的样品可以用样品稀释液稀释到500μL)。注意不要稀释对照。不同的样品要注意换吸头。在将样品加入检测板前要将样品充分混匀。
    2 洗涤液制备
    (10X)浓缩的洗涤液在使用前必须用蒸馏水或去离子水进行10倍稀释。如果浓缩液中含有结晶,在使用前必须将它融化。(如:30mL的浓缩洗涤液和270mL的蒸馏水或去离子水充分混合配成)。 
    3 操作步骤
    将试剂恢复至室温,并将其振摇混匀后进行使用。
    3.1 抗原包被板并在记录表上标记好被检样品的位置。
    3.2 取100μL不需稀释的阴性对照液加入A1孔和A2孔中。
    3.3 取100μL不需稀释的阳性对照液加入A3孔和A4孔中。
    3.4 取100μL稀释的被检样品液加入相应的孔中。所有被检样品都应进行双孔测定。

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