规范标准

炭疽防治技术规范

日期：03-21 作者：兽医局- 小 + 大

1.7 10×PCR缓冲液

1.7.1 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0)、三羟基甲基氨基甲烷 15.8g、灭菌双蒸水 80mL、浓盐酸调pH至9.0、灭菌双蒸水加至100mL。

1.7.2 10倍PCR缓冲液 1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL、氯化钾 0.373g、曲拉通X-100 0.1mL、灭菌双蒸水加至100mL。

1.8 溴化乙锭(EB)溶液

溴化乙锭 0.2g、灭菌双蒸水加至20mL、

1.9 电泳缓冲液(50倍)

1.9.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) ，二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g、灭菌双蒸水 80mL、氢氧化钠调pH至8.0、灭菌双蒸水加至100mL。

1.9.2 TAE电泳缓冲液(50倍)，三羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g，冰乙酸 57.1mlL，0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 100mL，灭菌双蒸水加至1000mL，用时用灭菌双蒸水稀释使用。

1.10 1.5％琼脂糖凝胶琼脂糖 3g、TAE电泳缓冲液(50倍) 4mL、灭菌双蒸水 196mL、微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液20µL。

1.11 上样缓冲液

溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100mL。

1.12 其它试剂

异丙醇(分析纯)、70%乙醇、15mmoL/L氯化镁、灭菌双蒸水。

2 器材

2.1 仪器

分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2µL 、20µL、200µL、1000µL）。

2.2 耗材

眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、0.2 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头(10µL、200µL、1000µL)、灭菌双蒸水。

2.3 引物设计

根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列，设计并合成了以下两条引物：

ATXU：5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ ATXD：5’-GTTGTAGATTGGAGC

CGTC-3’，此对引物扩增片段为394bp。

2.4 样品的采集与处理

2.4.1 样品的采集

病死或扑杀的动物取肝脏或脾；待检的活动物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送实验室检测。

2.4.2 样品的处理

每份样品分别处理。

2.4.2.1 组织样品处理

称取待检病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5 mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中4～16h。

2.4.2.2 待检菌的处理

取培养获得的菌落，重悬于生理盐水中。取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL 消化液和10µL 蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。