规范标准

炭疽防治技术规范

日期:03-21 作者:兽医局- 小 + 大

1.7 10×PCR缓冲液

1.7.1 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0)、三羟基甲基氨基甲烷 15.8g、灭菌双蒸水 80mL、浓盐酸 调pH至9.0、灭菌双蒸水 加至100mL。

1.7.2 10倍PCR缓冲液 1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL、氯化钾 0.373g、曲拉通X-100 0.1mL、灭菌双蒸水 加至100mL。

1.8 溴化乙锭(EB)溶液

溴化乙锭 0.2g、灭菌双蒸水 加至20mL、

1.9 电泳缓冲液(50倍)

1.9.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) ,二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g、灭菌双蒸水 80mL、氢氧化钠 调pH至8.0、灭菌双蒸水 加至100mL。

1.9.2 TAE电泳缓冲液(50倍),三羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g,冰乙酸 57.1mlL,0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 100mL,灭菌双蒸水 加至1000mL,用时用灭菌双蒸水稀释使用。

1.10 1.5%琼脂糖凝胶  琼脂糖 3g、TAE电泳缓冲液(50倍) 4mL、灭菌双蒸水 196mL、微波炉中完全融化,加溴化乙锭(EB)溶液20µL。

1.11 上样缓冲液

溴酚蓝0.2g,加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后,移入已溶解的溴酚蓝溶液中,摇匀定容至100mL。

1.12 其它试剂

异丙醇(分析纯)、70%乙醇、15mmoL/L氯化镁、灭菌双蒸水。

2 器材

2.1 仪器

分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器(2µL 、20µL、200µL、1000µL)。

2.2 耗材

眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、0.2 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头(10µL、200µL、1000µL)、灭菌双蒸水。

2.3 引物设计

根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列,设计并合成了以下两条引物:

ATXU:5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ ATXD:5’-GTTGTAGATTGGAGC

CGTC-3’,此对引物扩增片段为394bp。

2.4 样品的采集与处理

2.4.1 样品的采集

病死或扑杀的动物取肝脏或脾;待检的活动物,用注射器取血5~10mL,2~8℃保存,送实验室检测。

2.4.2 样品的处理

每份样品分别处理。

2.4.2.1 组织样品处理

称取待检病料0.2g,置研磨器中剪碎并研磨,加入2mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5 mL灭菌离心管中,再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液,混匀后,置55℃水浴中4~16h。

2.4.2.2 待检菌的处理

取培养获得的菌落,重悬于生理盐水中。取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中,再加入500µL 消化液和10µL 蛋白酶K溶液,混匀后,置55℃水浴中过夜。

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