兽药园地
猪源抗菌肽的研究进展
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3 抗菌肽的基因工程研究进展 在抗菌肽的基因工程技术中，通过抗菌肽基因的克隆与表达而大量生产抗菌肽是一种较为直接而有效的方法。研究表明，猪源抗菌肽基因表达方式有两种，即组成性表达和诱导性表达。 3．1 抗菌肽的表达体系 抗菌肽的表达体系主要有酵母菌、大肠杆菌、昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞表达体系。（1）酵母表达体系的表达产物可糖基化且属于分泌性表达，能适应工业化生产，但存在表达产物对宿主的杀灭作用。（2）大肠杆菌表达体系已经成功的表达了多种抗菌肽，但是存在产率不高和产物活性低等缺点。（3）Valore等(1998)成功地在昆虫细脚杆状病毒群蛋白表达体系克隆和表达HBD-1基因，但其最大缺点是外源蛋白处在极晚期病毒启动与调控下，而此时细胞已经开始死亡。（4）哺乳动物细胞表达体系表达真核蛋白时，主要表现在蛋白合成起始信号、加工、分泌、糖基化方面，但目前哺乳动物表达产量不高，成本较大。 3．2基因工程方法 在基因工程领域所运用的方法主要有以下两种： 一是利用差异显示技术(differential display DD)，对进行诱导和未进行诱导的生物的基因的差异表达进行研究，可得到一些新的抗菌肽类相关基因，这是关于基因分离、表达研究的较新方法。Kin等就利用差异显示技术分离到了一种新抗菌肽Enbocin他们用大肠杆菌感染家蚕(Bombyxmor}幼虫，构建cDNA文库，后以α-32pATP标记，选出感染的与未感染的Bombyxmori差异DNA克隆，在基因文库中用人DASH试剂筛选出阳性克隆，酶切、测序，得到Enbocin基因序列。据此设计引物从昆虫细胞mRNA进行RT-PCR扩增，在将此扩增片断导入克隆载体与表达载体，最后用Northern blot尿素-SDS-PAGE可证实并检测到Enbocin的表达。在国内，刘振义、屈贤铭也利用该方法成功得到了长度为241bp的片断，该片断可能在昆虫免疫反应中扮演重要角色。 二是采用融合表达的方法，该方法是将抗菌肽基因与另外一种基因连接起来，共同构建成融合基因，并克隆到表达载体上，最后在经诱导、切割而得到抗菌肽基因表达的蛋白。之所以采用这种方法，其原因是抗菌肽所携带的碱性氨基酸对蛋白酶非常敏感，而采用融合表达的方法以抵消其碱性并降低其对宿主细胞的毒性。庞实锋等通过PCR技术和体外DNA重组技术将CecmpinAD连接在haFGF改构体的5’端，构建成融合基因CADAF将其克隆到表达载体pET3c上，然后转化到BL21（DE3）中经IPTG诱导表达。经DNA序列分析，合成的CADAF基因序列与设计序列一致。构建的CADAF基因在BL21（DE3）中获得了表达。虽然现在抗菌肽的基因工程取得了很大的成就，但问题的存在也是不容忽视。比如如何进一步提高表达水平，提高基因表达产物的稳定性，设计并合成杀菌活力更强、杀菌谱更广的抗菌肽等，都是需要解决并值得深入研究的课题。 近年来，在昆虫和植物抗菌肽基因工程方面，国内外已有不少成功的报道，如抗菌肽天蚕素A、B已在昆虫系统中得到表达，柞蚕抗菌肽D、绿蝇抗菌肽在酵母系统中得到表达，天蚕抗菌肽A在真核系统中表达，但就畜禽抗菌肽基因工程国内外报道很少。因此，运用基因工程技术，通过对畜禽抗菌肽的研究，对提高畜禽的抗病能力、减少甚至替代抗生素的使用将起积极的促进作用。目前，在猪的抗菌肽方面国内已有了一些研究，如罗刚等已建立了猪PMAP-37的基因和防御素PD表达载体；汪以真等对猪PR-39基因进行了克隆和序列分析。但在畜禽抗菌肽的基因表达尚未见报道。 4 展望 由于长期以来抗生素的大量应用，许多细菌产生了耐药菌株，而新型抗生素的研发速度又不够快，因此矛盾日益突出。抗菌肽独特的抗菌机理为这一问题的解决提供了可能。另外，抗生素在畜产品中的残留问题也越来越引起人们的重视，它直接危害到了人类的健康，通过基因工程的方法生产出的抗菌肽添加剂为解决该问题提供了有效的途径。 抗菌肽作为新型的抗菌药物不但能够很快的杀灭微生物，同时也不易产生耐药性，因此使得其在细菌性疾病的治疗、畜禽饲料添加剂、生物制药等方面都显示出诱人的前景。相信随着抗菌肽研究的不断深入，在不久的将来，抗菌肽将在解决上述问题上发挥重要作用。 |
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