规范标准
牛冷冻精液国家标准
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2.4 冷冻 2.4.1 制备冻精的操作室，应符合牛人工授精技术操作规程。 2.4.2冻精的器具 2.4.2.1 细管冻精，应采用与细管配套的器具进行。 2.4.2.2 颗粒冻精，采用聚四氟乙烯板(简称氟板)、铜纱网、尼龙网或铝板均可。 2.4.2.3 安瓿冻精，采用净容量为0.5mL的硅酸盐中性玻璃安瓿。以上各种用具，在冻精时，精液容器与液氮面的距离，一般保持1—1.5cm，初冻温度-80—120℃。 精液在冷冻前，应充分混匀，并检查精子活力。 细管精液，不论是用聚乙醇封口、钢珠封口，还是超声波塑料热合，都必须将口封严。 颗粒精液。每毫升稀释精液，滴冻(10士1)粒，滴管应事先预冷。操作要准确、规整，每冻完一头公牛精液之后，必须更换滴管、 氟板等用具。 安瓿精液，用酒精喷灯火焰封口。在制作冻精时，不论是细管、颗粒和安瓿，均应始终注意防止精液湿度回升。 每冻完一批(头)精液，应立即故人液氮中泡浸，然后计数，取样检查和包装。 3 检查方法 3.1 精子活力检查 3.1.1 颗粒冻精，应先取2.9％二水柠檬酸铀1—1.5mL，加温到38℃土2℃，投放冻精一粒，轻轻摇荡，使之迅速溶化，用压片法，立即在显微镜下检查。 3.1.2 细管、安瓿冻精，解冻后应混匀，用压片法在显微镜下检查。 3.1.3 评定精子活力的显微镜放大倍数，以150—160为宜。 3.1.4 精子死亡百分率检查，可采用染色法或升温血球计计算法。 3.1.5 检查用的显微镜载物台温度，应保持38—40℃；也可 用显微镜和闭路电视的连接装置，在荧光屏上检查。 3.1.6 每批冻精，应随机取样两份，分别解冻检查。每个样品应观察3个以上的视野，注意不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。 3.1.7 检查次数，应在冷冻后当时一次(或间隔24h再做一次)，合格者贮存。冻精发放前再抽样检查，合格者方准予发放。 3.2 精子密度检查 3.2.1 检查用具：以用血球计算器为准；用光电比色计或其他电子仪器检查，都必须用血球计算器做出可靠的校正值。 3.2.2 每批冻精应进行密度检查，以确定稀释比例。 3.3 精子畸形率定期抽样检查 取新鲜和解冻后的精液样品，放在载玻片上，按常规方法制成抹片，风干后在显微镜下检查畸形精子数，每个精液样品应观察精子总数500个，计算其中畸形精子百分率。不合格者，不得制作冷冻精液和贮存使用。 3.4 解冻后精子顶体完整率的定期抽样检查采用姬姆萨染色法镜检或用干扰相差(湿样品)镜检，每个样品观察精子总数500个。 3.5 冻精中细菌定期检查 取0.2mL解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在37℃恒温箱中培养24h，统计出现的菌落数。 3.6 解冻后的精子存活时间定期检查细管、安领冻精解冻后不再稀释；颗粒冻精以2.9％二水柠檬酸钠液解冻，在5—8℃或37℃下贮存，在38—40℃下镜检。 上述定期抽样检查，每头公牛每月(下限)1次。 4 使用方法 4.1 解冻 4.1.1 细管、安瓿冻精，可用38℃土2℃温水直接浸泡解冻。 4.1.2 颗粒冻精，应一次一粒，用38℃土2℃1—1.5mL解冻液解冻；多于两粒时，应分别解冻。 4.1.3 解冻液配制 a.配制2.9％二水柠檬酸钠液，用2mL灭菌安瓿封装，解冻液净容量(下限)1.5mL。 b.蒸馏水100mL，葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.4g。 c.蒸馏水100 g，柠檬酸钠1.7g，蔗糖1.15g，氨苯磺胺0.3g，磷酸二氢钾0.325g，碳酸氢钠0.098，青霉素、链霉素各l0万单位。 4.1.4 解冻后的使用时间 细管和安瓿精液(上限)为1h；颗粒精液(上限)为2h。如解冻后的精液需要外运时；应采取低温(10—15℃)解冻，然后用脱脂棉或多层纱布包裹，外边用塑料袋包好，置4—5℃下保存。其使用时间(上限)为8h。 4.2 输精 4.2.1 每头发情母牛，每次输精应用解冻精液一个剂量(细管、颗粒或安瓿)。输精之前，必须再进行一次精子活力评定，不够标准者不许使用。 4.2.2应推行直肠把握子宫颈深部输精法 4.2.3 每一情期输精1—2次。要做到输精适时和输精器适深，慢插、轻注、缓出，防止精液逆流。 5 包装、标记、贮存和运输 5.1 包装 5.1.1 细管冻精应封闭良好 5.1.2 颗粒冻精必须用无菌容器包装。每一容器以装冻精50—100粒为一个单位。 5.1.3 安瓿冻精可放在液氮生物容器的提筒中，应防止碰撞。 5.2 标记 5.2.1 细管、安瓿表面和盛装颗粒冻精的容器外面，均应有鲜明的标记。注明站代号[按国家统一规定的省、市、自治区的代号]、公牛品种、名号、精液制冻日期(年、月、日或批号)以及该批冻精的精子活力和份数。 5.2.2 不同品种公牛的冻精，可用不同颜色包装加以区别；其包装颜色和公牛品种、品种代号见表。 |
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