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Pushko P等[7]扩增H9N2亚型流感病毒A/Hongkong/1073/99 (H9N2)株的HA、NA和M1基因，克隆至pFastBac1杆状病毒转移载体上，转染昆虫细胞系sf9，获得大量表达的HA﹑NA和M1蛋白，并自动组装成直径为80 nm～120 nm的病毒样颗粒，该病毒样颗粒具有流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)活性，肌肉注射免疫Balb/c小鼠，抗体效价在104～105之间，能有效阻止流感病毒在上呼吸道和肺部的复制。Pushko P等[8]在重组的HA蛋白中加入Novasome佐剂，增强了重组蛋白的免疫原性，使用更少的重组蛋白即能产生良好的免疫效果。杆状病毒表达系统由于具有蛋白翻译后加工过程，与原核表达的蛋白相比更接近病毒蛋白的原始构象，在亚单位疫苗的开发中具有良好的运用前景。
4 核酸疫苗
核酸疫苗又称DNA 疫苗，是利用重组DNA技术将编码保护性抗原蛋白的基因克隆到真核表达载体上，在被直接导入到动物体内后，保护性抗原蛋白基因表达的抗原蛋白经内源性途径呈给免疫系统，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。Qiu M Z等[9]用H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/7/2002株感染Balb/c小鼠，传至5代后，A/Chicken/Jiangsu/7/2002株能在小鼠肺内稳定增殖，并能致死小鼠。用表达同源H9N2亚型的HA和NA基因的核酸疫苗免疫小鼠，一免或二免后用致死量的A/Chicken/Jiangsu/7/2002株攻毒，观察小鼠存活时间，测定小鼠血清抗体效价和肺组织内病毒残留滴度对免疫保护效果进行评价。结果显示，用10 μg表达HA和NA基因的核酸疫苗免疫一次能有效保护同源H9N2亚型禽流感病毒的攻击。
核酸疫苗能长时间表达抗原，避免母源抗体的干扰，并且没有散毒及毒力回升的危险，但现今开发的核酸疫苗存在在体内表达效率不高，免疫保护效果不好等缺点，需要进行进一步的研究才能用于实际生产。
5 通用疫苗
禽流感病毒亚型众多，各亚型表面抗原基因易发生漂移和转换，是流感病毒防控的难点，如何能寻找一种“通用疫苗”，对各亚型具有交*保护，是流感病毒防控策略之一。研究表明，A型流感病毒M2蛋白在各亚型之间相对保守，是有效的疫苗靶点，为通用疫苗的开发奠定了理论基础[10]。Ernst W A等[11]扩增H1、H5和H9亚型流感病毒M2蛋白外功能区M2eA表位片段，将其融合构建于带有疏水蛋白的表达载体(如pET28a)上进行融合表达，以脂质体为佐剂免疫小鼠。结果表明，M2eA表位疫苗能刺激机体产生针对M2eA表位的IgG亚型抗体，显著减少流感病毒在呼吸道的复制和增殖，用致死量的同源性H1N1和H9N2亚型病毒攻击免疫小鼠，保护率分别为100%和80%，用致死量的H6N2亚型流感病毒进行攻击，保护率为100%。表明M2eA表位疫苗对各亚型流感病毒均有一定保护效果，为流感病毒通用疫苗的研究奠定了基础。
6 反向遗传技术在禽流感疫苗开发中的运用
反向遗传技术(reverse genetics)又叫“病毒拯救(rescue of virus)”，是近几年研究的一项新方法，应用于病毒研究。病毒拯救技术是在了解病毒复制的特点等的基础上，利用分子生物学技术建立和完善起来的，是通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式在一定条件下转染细胞，产生有感染性的病毒粒子。经过多年的发展，现在病毒拯救指的就是完全以质粒为基础的系统，即从克隆的cDNA产生病毒的过程[12]。病毒拯救在对病毒的生活周期、基因结构与功能、致病基础、新型疫苗构建、表达外源蛋白等方面的研究中显示了良好的应用前景[13]。Neumann G等[1415]分别报道了完全以质粒为基础的流感病毒拯救，允许人工对流感病毒基因进行操作，引入预期突变位点，使重组病毒具有预期(冷适应、减毒等)表型，为流感病毒新型疫苗的开发提供了有力工具。反向遗传技术已成功用于人用流感病毒减毒活疫苗的开发，2003年在美国，应用反向遗传技术开发的流感病毒减毒三价活疫苗FluMist™被批准和投入使用，该流感减毒活疫苗在成年人和儿童中都有良好的安全性，可以有效预防流感[16]。该技术也已用于禽流感病毒的研究，石火英等[17]应用反向遗传技术将含有1998 年中国大陆分离株H9N2 亚型禽流感病毒的8个基因片段的质粒共转染COS1 细胞，产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV。应用反向遗传技术，可将具有低致病性的H9N2亚型禽流感病毒作为骨架病毒，与不同毒株的表面HA、NA基因进行重组，产生重配病毒，作为候选疫苗。可以预见，反向遗传技术将是以后开发有效禽流感病毒疫苗候选株的有力手段。
7 结语
禽流感病毒的亚型众多、分布广泛、传播渠道复杂，病毒自身的特点和疫苗选择压力使病毒容易发生重组、重排而使其抗原性和致病性发生变化，造成免疫失败，这些特点给禽流感的防治工作带来了很大的困难。H9亚型禽流感病毒对鸡群的低致病性更使人容易忽略，因此，对禽流感病毒进行连续的分子病毒学监测，分析禽流感病毒变异规律，筛选出合适的疫苗株，应用先进的分子生物学技术研制出高效、安全、工艺简单、价格低廉的禽流感疫苗是禽流感病毒研究者努力的方向。
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