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猪传染性胃肠炎基因工程疫苗的研究进展
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四、重组活载体疫苗的研究 OrtegoJ 等发现重组TGEV (rTGEV)在细胞培养物上的繁殖效率和野生型病毒相同，而且也很稳定，但在猪肺内和感染仔猪的肠道内的繁殖水平和毒力都显著降低，不表达基因7 的重组传染性胃肠炎病毒(rTGEV-D7)可通过构建的cDNA 恢复其表达活性。这表明TGEV 基因7 是病毒繁殖的非必需基因。值得注意的是，活体接种 rTGEV-D7 后，病毒在肠道和肺中的复制减少，毒力降低，表明TGEV 基因7 影响病毒的致病性。PaulP S 等观察到致病性不同的PRCV 分离株的一个特点就是在基因3 上有差异，在两种强毒PRCV 分离株中基因3 保持不变，而在两个弱毒TGEV 毒株中的基因3 有变异。对TGEV 也有相似的报道，产生小噬斑的非致病性突变体的基因3 有核酸缺失，因而推测基因3 可能是冠状病毒在猪体内的毒力和体外复制的重要决定因素。O.Connor J B等发现TGEV 基因3b 编码一个功能未知的、分子量为27.7 kDa 的非结构多肽，此多肽在体外翻译时经糖基化后成为31 kDa 的整合膜蛋白。在TGEV 强毒 Miller 株中，ORF3b在mRNA3-1 的5ˊ端，认为其在5ˊ端帽子结构依赖性的核糖体进入处开始翻译。而其它3 株TGEV 株，强毒英国FS772/70 株、台湾TFI 株和弱毒Purdue-116 株都不存在mRNA3-1，因而推测ORF3b 可能是由mRNA1 和mRNA2 表达。 五、转基因植物疫苗 转基因植物疫苗是通过植物基因工程技术与机体免疫机理相结合的原理，利用农杆菌或基因枪等技术，将免疫原性基因导入植物中从而获得有免疫原性蛋白表达的基因疫苗植株，然后把转基因植物组织饲喂给动物，转基因植物表达的抗原呈递到动物的肠道淋巴组织，被其表面特异受体识别，产生粘膜免疫和体液免疫反应。在过去的十几年中，许多的研究工作已经证实植物疫苗是切实可行的。由于植物疫苗具有生产、贮运简单，无污染，无副作用等优点，利用植物来表达抗原生产疫苗越来越引起大家的兴趣。自从1992 年Mason 等人提出利用转基因植物作为疫苗的概念以后，一些来源于人和动物的病原体抗原的口服免疫原性在转基因植物中得到表达。Walmsley 和 Arntzen 对技术以及其发展做了较为总体的介绍。Gomze 将TGEV 的S 基因转化到 Arabidoposis 的种子中，植株生长的大多数叶子可用特异性单克隆抗体检测到S 基因表达的多肽，用其叶子饲喂小鼠可以在鼠血清中检测到中和抗体。目前还有一个研究方向，就是将克隆并修饰的致病大肠杆菌热敏肠毒素B 亚单位 LT-B 基因和TGEV 的S 基因分别导入土豆基因组，利用LT-B 的粘膜免疫剂作用和载体效应克服单独表达S 基因可能具有的免疫耐受性，选取表达水平较高的阳性转基因土豆克隆繁殖后喂猪，使动物建立免疫。现在猪传染性胃肠炎冠状病毒的S 蛋白已经被转入烟草、马铃薯、玉米、拟南介等植物中，有的已经进行动物饲喂试验，并检测到抗体的产生。 六、前景及展望 近年来对TGEV 分子水平上的研究，如病毒基因组结构、核酸序列、结构蛋白和基因工程等方面已取得较大进展，但在以下几个方面还有待深入的研究。 第一 由于母乳提供的免疫不能从根本上解决猪群，特别是仔猪的免疫问题，因此进行TGEV 基因工程活载体疫苗研制及区域性免疫试验，研制TGE 和猪流行性腹泻( PED) 基因工程多价疫苗及转基因植物疫苗，必将有广阔的应用前景。 第二 由于TGEV 和PRCV 的抗原关系非常密切，基因核酸序列和抗原结构极其相似，S 蛋白的D 位点PRCV 中缺乏TGE 和PED 的症状极为相似，因此建立鉴别TGEV、PEDV 和PRCV 的快速、特异、敏感的血清学和病原学检测方法，在诊断和动物检疫中具有重要的应用价值。 第三 TGEV 病毒株之间的变异对致病性的影响、非结构蛋白的功能、诱导干扰素的机理、各地分离毒株核酸序列的问题也有待深入细致的研究。 第四 目前对TGE 病原的研究较多，但对sM 蛋白和非结构蛋白的功能、血凝素及其基因的结构和性质、抗TGEV 感染的保护性免疫机制及新型疫苗的研制等有待于深入的研究。 第五 发展转基因疫苗的关键因素在于提高外源基因的表达效率，由于插入位点的随意性可导致在表达过程中呈现多层次的表达，而同时使用不同的表达启动子和增强子，使用不同的植物（动物）信号肽和前导序列，以及对这些蛋白质的遗传密码作怎样的修改，可能对提高表达水平有很大的帮助, 因此如何使外源基因 表达效率更高是发展可食疫苗的研究方向之一。 目前的研究结果表明，S 基因的合理剪切对于抗原活性没有太大的影响，并且操作性增强，更有利于和某些信号肽基因拼接重组，从而使S 蛋白能顺利到达靶部位或使外源基因在某些组织得到高效表达。因此对于保留抗原位点的S 基因采用怎样的包埋手段或与怎样基因重组并进行转基因研究也是其中的一个发展方向。 |
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