六种家禽免疫抑制病及检测方法

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验主要是通过酶的强烈催化作用使无色的底物发生一定的化学反应形成有颜色的产物，然后人工进行观察或用分光光度仪进行含量检测。该试验的优势是在每次加入试剂孵育后，进行洗涤以去除多余的游离状态的反应物，具有很好的特异性和敏感性；试验可以通过不同的步骤和方法设计来达到不同的试验目的，如双抗体夹心法、间接法，使用灵活；试验快速并且结果可靠。劣势是干扰因素太多、重复性不好，其中受温度和时间的影响最大，此外还容易受到自身抗体等因素的干扰而导致结果出现假阳性。

聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）技术是一种酶促化学反应，通过在试管中利用 PCR 技术将需要检测的目的基因在体外短时间内扩增几十万甚至上百万倍，从而极大地提高了诊断结果的灵敏度。

目前主要有定性和定量两种，每种的检测产物方式和扩增的方法都不一样。第一代技术主要是通过琼脂糖电泳的方式对产物进行分析。第二代则是通过荧光定量方式进行，这是一种使用非常广泛的新型核酸定量技术，在普通的 PCR 仪上增加一个激发和检测荧光的装置就变成了荧光 PCR 仪，随着这种仪器在市场上的大量推广，该方法也得到了相关研究人员的积极采用。这一代技术主要是在相对于普通的 PCR 而言在反应体系中加入了一条标记了荧光报告基团 R、荧光抑制基团 Q 共两个基团的标记探针，其中荧光报告基团 R 标记在探针的 5’端，荧光抑制基团 Q 标记在探针的 3’端。3’端的荧光抑制基团 Q 在距离 5’端的荧光报告基团 R 较远时，对后者的抑制作用就会消失，从而导致荧光报告基团 R 的信号变强；如果两者相距较近，则抑制作用会造成最终的信号变弱。在反应过程中每经过一次循环收集一个荧光强度信号，从而通过对荧光信号强度变化来实时监测产物量的变化，达到通过一条荧光扩增曲线来实时检测整个 PCR 的反应过程。在整个扩增的过程中，只有荧光信号指数扩增阶段才存在 PCR 产物量的对数值与起始模板量之间的线性关系，在这之前的荧光背景信号阶段和之后的平台期均因扩增产物变化不明显导致不存在线性关系。目前，该技术已经逐渐发展到以微滴化处理步骤进行的第三代。

常规 PCR 技术相对于其它方式具有其独特的特异性、敏感性优势，但是当这种技术面对多个需要扩增片断时不得不多次反复重复操作步骤，存在无法一次对两对或以上的目标基因序列同时进行扩增的劣势。随着技术的发展，多重 PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction, MPCR）技术应运而生，这种技术通过引入多对的引物来对两对或者两对以上的目标基因序列进行扩增。在体外扩增片断时，同荧光双链探针通常是由两条寡合核苷酸链组成，它们不等长但互补，长链的 5’端标记有一个荧光基团，而其互补链的 3’端标记的是淬灭基团，两个基团靠近时会导致荧光淬灭从而检测不到信号，如果二者分开，荧光信号就会重新出现。多重 PCR 技术成功实现了一次反应中可以检测多重特异基因，在需进行多重检测的情况下具有很高的现实操作使用价值。

反转录多重 PCR 法反转录多重 PCR（multiplex  reverse  transcription  PCR，m RT-PCR）法是在多重 PCR  的基础上再增加了一个反转录的步骤，提取到细菌的m RNA  后通过反转录成 c DNA，并且对 c DNA  进行 PCR  的目的基因序列扩增和后期的分析。因为 m RNA  只会存在于细胞进行复制的过程中，其他事件并不出现，所以用它来替代 DNA  进行 PCR  可以避免死亡菌体的 DNA 对结果造成影响，更为准确的反映出细胞的生存情况是否正常，大大提高结果的敏感性。

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