非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法（团体标准）

时间：2019-08-09 点击：次来源：中国兽医协会作者：倪建强、王传彬等 - 小 + 大

三、附录C（规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照

C.1阳性对照

阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。

C.2 阴性对照

阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。

四、附录D（规范性附录）实时荧光PCR反应液配方

实时荧光PCR反应液配方见表D.1。

表D.1 实时荧光PCR反应液配方

组分	1个检测体系的加入量
2×PCR 缓冲液a	12.5μL
dNTP（2.5 mmol/L）	1.0 μL
上游引物（10 μmol/L）	1.0 μL
下游引物（10 μmol/L）	1.0μL
探针（10 μmol/L）	1.0 μL
Taq 酶b（5U/μL）	0.5μL
去离子水	3μL
总体积	20μL
2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。 Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。

五、附录 E（资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考

图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。

图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图