单碱基编辑技术及其在动物育种中的应用研究进展

2019年，赖良学课题组将胚胎注射和体细胞核移植等动物创制方法与单碱基编辑技术相结合，分别在猪的细胞、胚胎和个体3个水平上对猪的多基因位点进行单碱基编辑，培育出了单基因突变的早衰猪模型和杜氏肌肉营养不良猪，同时也得到了与免疫机能相关的多基因突变的缺乏B细胞、T细胞和NK细胞的免疫缺陷猪；Zhou 等把BE3 的编码mRNA 和sgRNA注射到绵羊受精卵中， 对细胞因子信号抑制2基因（Suppressor Cytokine Signaling 2，Socs2）实现了目的性的精准突变，获得了在体型、体重和产奶量等性状上明显优于野性型羔羊且生长状况良好的基因编辑羊，后续研究发现Socs2 Indels也可以在炎症肠炎状况下有效保护骨骼健康；Li 等、Wang等结合BE3系统和显微注射技术对单细胞胚胎中的成纤维细胞生长因子5（FGF5）编码基因进行高效精确的碱基编辑，后续检验发现，FGF5 基因编辑山羊毛纤维显著长于野生型山羊，毛囊也显著多于野生型山羊。

2020年，Zhou等根据骨形态生成蛋白受体1B（BMPRIB）基因p.Q249R位点的序列信息设计了包含目标突变的sgRNA，将其与ABE（ABE7.10、ABEmax或 xCas9-ABE）质粒共转染入绵羊成纤维细胞中筛选了高效的ABE版本，之后结合胚胎显微注射技术成功创制了携带高效率编辑基因的后代羔羊，证明了利用ABE系统在大型动物中进行单碱基编辑的可行性，并为改善动物生产提供了替代方法，有助于验证农业重要特征的关键SNP。

总而言之，单碱基编辑技术在动物育种中相较于之前的前3代基因编辑技术极大地提升了编辑效率和编辑精度，在前3代技术覆盖的大部分领域都能发挥重大的作用，能够有效地推进遗传改良的进度，提升改良育种效果。

3 单碱基编辑技术发展与展望

碱基编辑技术是在CRISPR/Cas9系统的基础上发展建立起来的。相比于 CRISPR/Cas介导的HDR编辑，其最大优势就是可以在不产生 DSB的情况下实现高效精准的编辑，显著提高基因编辑的精准度，在作物遗传改良与家畜育种研究中，碱基编辑技术展现了很好的应用前景，但仍存在一些不足。一是效率问题，虽然相较于之前的基因编辑技术，单碱基编辑系统的打靶效率显著提高，但大部分位点效率在20%~40%（植物中），仅在个别位点上能够达到60%以上，PE编辑系统的效率更为低下；二是应用范围的限制，大多数单碱基编辑系统都是对于特定位置碱基进行编辑的，虽然现在许多研究人员都对Cas蛋白进行了改造，产生了多种可以选择的PAM位点，但还是无法满足基因编辑的实际应用需求；三是脱靶现象，相较于常规CRISPR/Cas9技术，单碱基编辑系统不需要产生DSB，显著降低了脱靶效率，但仍存在一定的脱靶现象。未来的单碱基编辑技术将以这3个问题为主要发展的方向，即开发出应用范围更广、编辑位点更精确、更低脱靶概率的单碱基编辑系统。综上所述，单碱基编辑技术虽然已经在人类遗传疾病研究及相关动物模型制备、药物开发、动植物育种等方面显现出巨大潜力，但并未完全满足实际的基因编辑需求，在编辑精度和编辑效率上面还存有很大进步空间，在应用中也存在着一些限制，尤其是编辑窗口的限制。

因此，如何使碱基编辑系统摆脱编辑窗口的限制，实现sgRNA覆盖范围内所有位点的高效率精准编辑，将是未来研究中的重大课题。随着单碱基编辑技术的不断完善成熟，相信单碱基编辑技术会成为强有力的生物研究工具，极大地推动全世界生物科学相关领域的快速发展。

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