单碱基编辑技术及其在动物育种中的应用研究进展
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为进一步提高编辑效率，Komor还挑选了4种胞嘧啶脱氨酶进行测试， 分别是人类源AID酶和APOBEC3G酶、鼠源APOBEC1酶和来自七鳃鳗的CAD1酶，体外实验证明，鼠源APOBEC1酶的脱氨基活性最高，当其与dCas9蛋白的氨基端融合时，它们之间以一段XTEN 连接器连接（一段非结构重组多肽，目的在于提高融合蛋白的稳定性），XTEN连接器的长度影响脱氨基窗口的大小，越长则窗口越大，且其长度的合理增加也会使脱氨基效率得到提升。研究证明，当XTEN 连接器长度为16AA时，脱氨基精度与脱氨基效率之间能够取得最佳平衡，脱氨基窗口大小为5 nt，在前间隔序列邻近基序（PAM）位点前的4~8个核苷酸。APOBEC1-XTEN- dCas9 结构为第一代CBE系统，称为BE1。 2016 年，日本科学家基于AID（Activation- Induced Cytidine Deaminase，AID）同源PmCDA1和dCas9或Cas9n以及鸟嘌呤糖苷化酶抑制子UGI的融合，开发了有别于BE1 的一种碱基编辑系统；同年，Ma等也发现DNA碱基编辑的新方法，开发了基于哺乳动物的靶向AID介导的核苷酸突变（TAM），通过把诱导抗体高频突变的胞嘧啶脱氨酶AID与核酸酶缺陷的Cas9蛋白（dCas9）融合，在sgRNA的引导下靶向结合目标DNA 序列，使胞嘧啶和鸟嘌呤可以随机地向其他3个碱基转变。 1.1.2 ABE 的建立与原理 2017 年，Gaudelli等于Nature杂志上发表文章，阐述了ABE 的研发过程及原理（图2）。相较于CBE，ABE将胞嘧啶脱氨酶替换成了腺嘌呤脱氨酶。在ABE 碱基编辑系统的工作过程中，腺苷被水解去氨酸产生肌苷，肌苷在聚合酶活性位点的限制下能与胞嘧啶（C）配对，并被读取或者复制为鸟嘌呤（G）。腺嘌呤脱氨酶对DNA 链上的腺嘌呤产生脱氨基作用是创建ABE 系统的理论基石，但是在此前的研究中，腺嘌呤脱氨酶都只能作用于游离腺苷，无法作用于DNA链上的腺嘌呤，故而寻找能对于DNA链上腺嘌呤产生作用的腺嘌呤脱氨酶成为解决问题的关键。Gaudelli等对于一些可能具有相关腺苷脱氨能力的酶进行了改造与筛选，在此过程中，一种存在于大肠杆菌中名叫TadA的脱氨酶进入其视线。Gaudelli等研究发现，A106V 和D108N 突变的TadA酶具有DNA链上的腺嘌呤脱氨基能力，将改造的TadA酶（TadA*）与Cas9 D10A刻痕酶（取代了dCas9，便于定位信号的添加）结合，并在C端加上定位信号（NLS）， 结构为TadA*-XTEN-nCas9-NLS，构成了第一代腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），被称为ABE1.2。 1.1.3 PE 的建立与原理 2019 年，Anzalone等在Nature杂志上介绍了PE 的建立过程和原理（图3），它能够实现目标序列碱基的插入删除和12种类型的碱基自由转换。PE系统的主要元件包括Cas9n（Cas9 H840A位点突变 ） 蛋白、逆转录酶（Reverse Transcriptase，RT）、编辑引导RNA（peg RNA， 既能指示目标位点，又包含取代目标DNA 核苷酸的新遗传信息）。其主要工作原理为在peg RNA的引导下，Cas9n 蛋白结合到目标位点并切断靶DNA，断裂的靶DNA链与pegRNA 上的PBS序列互补结合，RT酶使peg RNA 发生逆转录反应，待逆转录反应完成后，DNA切口处出现3'flap结构和5'flap结构的动态平衡（3'flap 结构上有目标突变，而5'flap结构上没有），但5'flap结构更易被结构特异性内切酶切除， 3'flap结构和5'flap结构的动态平衡会向5'flap结构这边倾斜，之后经过DNA 链的连接和修复便实现了目标序列的替换。Li等经过大量实验分析证明，PE系统编辑效率与同源修复相当且副产物少，脱靶效应也比传统的CRISPR/Cas9技术低。 |
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