猪肉中氟苯尼考残留量高效液相色谱-串联质谱检测方法的建立
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2.3 基质标准曲线的绘制 吸取适量系列混合标准工作液，加入“2.2 样品处理”所述残渣复溶后的空白溶液，制备空白基质溶液，使其进样终浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、4 000 ng/mL，进行液相色谱-串联质谱测定，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，以对应的基质标准溶液浓度为横坐标，绘制基质标准曲线，计算标准曲线回归方程以及相关系数。 2.4 仪器条件 色谱柱：安捷伦科技有限公司的Agilent Zebox C18 色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，流动相A为0.1％氨水，流动相B为乙腈，流速300 μL/min，进样量25 μL，柱温40 ℃。液相洗脱梯度：0 min～1 min维持85％ A；1 min～2 min线性变化至15％ A；2 min～3 min维持15％ A；3 min～4 min线性变化至85％ A；4 min～5 min 维持85％ A。 电离源：电喷雾离子源，采用正/负离子混合模式；扫描方式为选择反应监测(SRM)模式；传输毛细管温度350 ℃；干燥气温度300 ℃；鞘气压力310.26 kpa；辅助气流速12 L/min；Ion Sweep气体压力13.79 kPa；电子倍增器电压3 700(+)/3 500(-) v；碰撞气为高纯氩气(纯度为99.99％)；离子源选择电喷雾离子源(ESI)。氟苯尼考胺选择248.1/229.9(定量离子)，碰撞能量10，248.1/130.1(定性离子)，碰撞能量20；氟苯尼考选择，－355.9/－335.9(定量离子)，碰撞能量13，－355.9/－184.9(定性离子)，碰撞能量19。 2.5 检测限(LOD)和定量限(LOQ)的确定 5个空白猪肉平行样品，按照“2.2 样品处理”所述方法前处理后上仪器检测，测得基线噪音，将信噪比≥3时的浓度定为检测限，信噪比≥10时的浓度为定量限。 2.6 准确性 准确性用添加样品回收率表示，于 50 mL聚丙烯的离心管中称取3份5.00 g(±0.05 g)均质好的空白猪肉样品，每份样品分别加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL的混合标准工作液0.1 mL，使混合标准工作液在各样品中的浓度分别为20 ng/g、40 ng/g和1 000 ng/g。通过“2.2 样品处理”所述方法前处理后，上机检测的各样品最终上机浓度为10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/g，进样体积为25 μL，HPLC-MS/MS测定定量离子峰面积，同时用HPLC-MS/MS测定对应浓度的混合标准工作液(10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/mL)的定量离子峰面积。各个浓度分别重复5次，回收率的计算公式如下： 式中：A为预处理后组织中氟苯尼考、氟苯尼考胺的实测定量离子峰面积； AS为对应浓度的混合标准液中氟苯尼考、氟苯尼考胺的定量离子峰面积。 2.7 精密度 精密度以空白猪肉添加样品测定的日间变异系数和日内变异系数表示。称取3份 5.00 g(±0.05 g)均质的空白猪肉样品，装入50 mL聚丙烯离心管，分别加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL混合标准工作液0.1 mL，使混标在各组织中的浓度分别为20 ng/g、1 000 ng/g和4 000 ng/g。按“2.2 样品处理”所述的方法处理，上机检测的各组织最终浓度为10 ng/g、500 ng/g、 2 000 ng/g，取25 μL滤液进行HPLC-MS/MS测定，同时用25 μL对应浓度的混合标准工作液(10 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL)，进行HPLC-MS/MS测定。各浓度样品同一天内重复测定5次，HPLC-MS/MS测得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量离子峰面积，用标准曲线回归方程计算各样品药物浓度，求出日内变异系数。一周内5 d分别检测三个浓度样品，每个样品重复测定5次，HPLC-MS/MS测得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量离子峰面积，用标准曲线回归方程计算各样品药物浓度，求出日间变异系数。 3 结果 3.1 基质标准曲线、检测限(LOD)和定量限(LOQ) 在以上质谱条件下，氟苯尼考和氟苯尼考胺标准工作液(药物浓度在10 μg/kg～4 000 μg/kg范围内)各个浓度与其峰面积成良好的线性关系(R2≥0.99)，方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为5 μg/kg和10 μg/kg。氟苯尼考回归方程为Y＝9 816.3x＋301 250，R2＝0.998；氟苯尼考胺回归方程为Y＝67 312x－403 487，R2＝0.999。 |