褪黑素在牛体外胚胎生产中的应用研究进展

孙业清研究发现褪黑素处理精子会显著降低精子细胞内的ROS水平，质膜、线粒体膜和顶体完整的精子比例提高，精液品质得到明显改善。Cheuquemán等报道褪黑素浓度对公牛精子有模式效应，在生理浓度下具有获能调节作用和保护作用。随着牛产业的逐步发展，性控精液在牛场繁育过程中扮演者重要角色。褪黑素不但对常规选择下的精子起作用，其对性别控制选择的精液也有着重要作用。Li等研究发现褪黑素会显著降低公牛性别分离精子的ROS水平，提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，抑制磷脂酰丝氨酸外化和丙二醛水平，提高线粒体膜电位Δψm、顶体完整率和受精能力，从而提高体外受精效率。

3 褪黑素在牛早期胚胎发育中的作用

在体外受精（IVF）后，受精的卵母细胞在体外培养 7 d，20%~40% 的受精卵到达囊胚阶段。家畜胚胎含有较高含量的脂质，在早期胚胎发育过程中起着重要的能量代谢作用。体外胚胎生产效率较低的原因可能与胚胎暴露在相对较高的氧气浓度下有关，这会导致ROS的产生增加。ROS 的产生被认为是体外胚胎产量低的主要原因，这是由于过量的ROS会与脂质相互作用，从而破坏关键的细胞分子，导致膜完整性丧失、蛋白质结构或功能改变以及核酸损伤。ROS还参与线粒体改变、胚胎阻滞、ATP耗竭和细胞凋亡等进程进而影响胚胎的发育和着床。

Wang 等研究发现褪黑素上调促类固醇基因CYP11A1、CYP19A1 和STAR 表达，促进卵丘-卵母细胞复合体（COCs）孕酮和雌二醇的分泌；褪黑素通过降低胚胎内的ROS水平提高牛的孤雌生殖、雄核胚胎发育、胚胎卵裂率和桑椹胚、囊胚发育率。在胚胎体外培养液中添加褪黑素可以促进牛胚胎的体外发育，上调牛胚胎发育过程中抗氧化抗凋亡基因GPX4、SOD1和BCL2和发育相关重要基因SLC2A1、DNMT1A和DSC2的表达，同时下调促凋亡基因P53、Bax和Caspase3的表达，提高卵裂率和囊胚率。Marques等实验表明褪黑素处理能提高囊胚发育效率，减少凋亡细胞数，增强抗氧化基因SOD2和热休克蛋白HSPB1的表达水平。

褪黑素和AKT（一种丝氨酸/ 苏氨酸特异的蛋白激酶）被确定为生殖所必需的几个细胞过程的调节器。El 等研究发现，褪黑素可以消除AKT 抑制剂SH6在牛卵母细胞和胚胎中的抗发育作用，具体体现在卵裂率和囊胚率的提高以及线粒体形态的改善；MARF1、GDF-9、BMP-15、MARF1、ATPase、ATP5F1E、POLG2、HAS2、TNFAIP6 和Ptgs2等成熟、线粒体和卵丘扩张相关基因表达上调，Bcl2 相关的凋亡调节因子Bax、caspase 3 和p21表达下调。

在明确褪黑素对牛早期胚胎的有益作用后，一些学者选择一些更有效的供给褪黑素方式来代替在体外添加。Komninou 等研究褪黑素纳米胶囊对牛胚胎体外培养的影响，发现褪黑素脂核纳米囊通过下调Bax、Casp3 和Shc1基因的表达，上调CAT和Sod2基因的表达，从而增加胚胎细胞数，降低细胞凋亡率和活性氧水平，提高胚胎孵化率。

以上研究均证实了褪黑素对牛体外早期胚胎发育有着重要作用，接下来研究人员转向研究在特殊情况下褪黑素在早期胚胎发育过程中的作用。Su等将褪黑素添加在体细胞核移植（SCNT）早期胚胎的发育液中，发现褪黑素影响凋亡、抗氧化和发育相关基因的表达，改变组蛋白H3的K9乙酰化，增加SCNT 囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数，减少SCNT 胚胎的凋亡和ROS水平，进而提高体细胞核移植牛早期胚胎的妊娠和出生率。Gutiérrez-A?ez等研究发现褪黑素可以改善初情期前的COCs在体外发育到囊胚的效率，在褪黑素添加后初情期前奶牛COCs的胚胎中胚胎细胞数达到成年奶牛水平。

4 褪黑素在牛配子和胚胎冷冻中的作用

配子和胚胎冷冻保存是胚胎工程中的重要环节，也是动物保种、基因库建立的必要手段。利用冷冻保存技术能够保存珍稀动物品种和优良生产性能家畜的遗传资源，促进转基因技术在生物医学研究方面的发展，推广胚胎移植技术在畜牧业生产中的应用。冷冻保存和胚胎移植可以经济、省力地储存和运输有价值的遗传物质，在降低疾病风险方面也有很大的优势。然而配子和胚胎的特殊结构导致其对低温十分敏感，配子和胚胎在冷冻解冻过程中也很容易产生ROS 和RNS，进而导致配子和胚胎受到氧化应激的影响和细胞器的损伤。

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