褪黑素在牛体外胚胎生产中的应用研究进展

摘要：近年来牛体外胚胎生产取得很大进展，可以稳定地在体外获得囊胚，但体外生产效率偏低，不能满足产业需要。在牛体外胚胎生产过程中很容易产生活性氧和活性氮，导致配子和胚胎受到氧化应激或硝化应激。褪黑素作为一种强有力的抗氧化剂和抗凋亡剂，可以直接清除有毒的氧衍生物，减少活性氧的形成，在牛体外胚胎生产过程中发挥积极作用。本文主要对褪黑素在牛卵母细胞体外成熟、体外受精、早期胚胎发育、配子和胚胎冷冻保存等方面的研究进行综述，为后续体外胚胎生产技术的优化研究和推广应用提供参考。

1 褪黑素在牛卵母细胞体外成熟中的作用

卵母细胞成熟包括发育中卵子的核和胞质成熟。卵母细胞核成熟是指在排卵时从第一次减数分裂前期到第2 次减数分裂中期（MII）的减数分裂过程。随着核成熟，卵母细胞内细胞器、蛋白质和转录本发生一系列变化，进而达到卵母细胞质成熟。在体外条件下，牛卵母细胞通常会在20~24 h完成核成熟到MII。

哺乳动物卵巢中存在褪黑素的膜受体和核受体，褪黑素在卵巢中的某些作用可能与膜受体有关。这些受体也存在于颗粒细胞和卵泡膜细胞中，表明褪黑素可直接作用于卵巢细胞，并调节卵巢相关生理活动。褪黑素膜受体mRNAs也存在于牛卵母细胞和牛卵丘细胞中，并对卵母细胞质和核的成熟有积极影响。

在体外成熟过程中，氧化应激是造成卵母细胞损伤的主要原因之一。体外处理过程中，卵母细胞长时间暴露在光线下，环境氧气浓度升高可导致ROS增加。研究发现在体外成熟培养液中添加褪黑素可以显著降低牛卵母细胞的ROS水平，并促进牛卵母细胞的体外成熟。El-Raey等研究发现，在成熟液中添加10、50 ng/mL 褪黑素可促进体外成熟卵母细胞从MI 期向MII 期的核转变，并且能够提高卵母细胞胞浆内线粒体弥散分布和卵丘细胞扩张的比率，获得较高的成熟率。Tian等研究发现褪黑素受体基因MT1和MT2在卵母细胞、卵丘细胞和颗粒细胞中都有表达，推测褪黑素对卵母细胞成熟的影响是通过受体实现。

褪黑素不但能促进体外牛卵母细胞的成熟，还能够缓解一些恶劣条件下的卵母细胞体外成熟。褪黑素可以挽救农药百草枯PQ对牛卵母细胞的损伤，通过抑制卵母细胞内ROS产生，提高谷胱甘肽GSH和抗氧化相关基因基因CAT和Gpx4 mRNA 水平，使丝裂原活化蛋白激酶p38MAPK信号通路失活，从而使凋亡相关的Bcl2/Bax mRNA比值发生有利的变化，从而阻止PQ诱导的细胞凋亡。Yaacobi-Artzi等研究发现，褪黑素通过降低ROS水平从而在一定程度上减轻热休克对牛卵母细胞减数分裂的影响，虽然热休克牛卵母细胞发育的囊胚比例不受褪黑素影响，但线粒体功能相关基因的表达相对较高。

以上研究表明，无论是在体内正常生理条件下，还是在体外应激及恶劣条件下，褪黑素对牛卵母细胞成熟都起着积极作用，然而不同条件下褪黑素作用的具体通路和机制还有待进一步研究。

2 褪黑素在牛体外受精过程中的作用

体外成熟完成后，通常对精子进行洗涤和选择，以去除冷冻液、精浆、碎片和死亡精子，精子与卵母细胞共孵育18~24 h，进行体外受精。牛精液的质量和卵母细胞成熟效果对牛胚胎体外受精至关重要。

褪黑素对牛卵母细胞体外成熟和卵母细胞体外受精起积极作用。在体外受精过程中，皮质颗粒（CGs）的胞吐（皮质反应）是卵母细胞用来防止多精受精的最常见机制之一，CGs的正常分布是确保单精子受精所必需的。Juno 蛋白在阻止多精受精方面也起着重要作用。Zhao等研究表明，褪黑素处理组的卵母细胞中CGs的正常分布率更高，Juno表达水平更高，结果证明褪黑素通过改善细胞器的正常分布，提高细胞内谷胱甘肽（GSH）和三磷酸腺苷（ATP）水平，增强抗氧化基因表达水平，调节受精相关事件，进而提高受精能力和发育能力。

精子在体外培养过程中易受氧化应激影响，这是因为精子的细胞膜富含多不饱和脂肪酸，对体外培养过程中产生的ROS很敏感，导致脂质过氧化（LPO），接下来产生细胞毒性醛（如丙二醛）等连锁反应。丙二醛可以与蛋白质结合并诱导关键细胞蛋白质的氧化修饰，对线粒体功能产生负面影响，并对精子的中段和轴丝结构造成损害。此外，LPO增加和膜功能改变可以通过降低新陈代谢、活力、顶体反应、反应性和融合能力，以及对精子DNA 的氧化损伤从而导致精子功能障碍，这些变化共同导致体外受精能力低下。

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