全球基因I型非洲猪瘟病毒流行与疫苗研究进展

2　弱毒活疫苗研发进程

基因 I 型非洲猪瘟传入欧洲后，给当地养殖业造成巨大影响。如 1960 年 4 月非洲猪瘟传入葡萄牙后，截止到 12 月已扩散至 16 个省份的 187 个地点，造成 14 629 头猪死亡或被扑杀，并于同年传入西班牙。为快速、有效控制该病，葡萄牙和西班牙均启动了弱毒活疫苗（细胞传代致弱株）的临床试验。葡萄牙临床试验规模达 55 万多头，而西班牙试验规模较小（交流所得）。但因种种原因，特别是弱毒活疫苗使用后的并发症问题超过了试验预期，最终导致试验终止。大规模临床试验不可避免导致毒株外溢，并被学术界认为与伊比利亚半岛随后 30~40 年间的低毒力毒株流行相关联。

特别是 1968 年葡萄牙从一慢性感染猪体内发现的无红细胞吸附活性的自然弱毒株 NH/P68 毒株（也称 NHV），经推测可能就是葡萄牙临床使用的弱毒疫苗候选株演变而来。1988 年，葡萄牙又从栖居于猪场的游走钝缘蜱（O. erraticus）中分离到无红细胞吸附活性的弱毒株，命名为 OUR T88/3、OUR T88/4 和 OUR T88/5 等。自然弱毒株 NH/P68 和 OUR T88/3 的发现为基因 I 型非洲猪瘟病毒疫苗研制提供了新方向。

2.1　自然弱毒株

2001 年，Leitão 等将 31 头 25~45 kg 的长白杂交猪以 5×106CPE50/ 头的剂量接种 NH/P68，结果肌肉注射和口鼻接种的猪中分别有 47%（9/19）和 25%（3/12）出现慢性病程（主要症状包括体温升高、皮肤坏死斑和关节肿大）。随后对无症状的猪以 5×106CPE50/ 头的剂量肌肉注射接种基因I 型强毒株 Lisbon 60，结果所有猪均能抵御强毒株攻击，但 79%（15/19）的猪有一过性体温升高（2~5 d）。另有试验证实，4 头杂交猪以105TCID50/ 头的剂量肌肉注射接种 NH/P68 后，于第 72 天再放入 2 头未接种哨兵猪，结果 4 头接种猪出现不同程度的慢性病程（症状包括体温升高、关节肿大、体重减轻和伴随阵发性咳嗽的呼吸困难），而 2 头哨兵猪中 1 头出现慢性病程（症状包括体温升高、关节肿胀和呼吸系统问题），1 头除有轻微体温升高外未有明显临床反应，但 2 头猪均抗体转阳。相似的，OUR T88/3 的接种试验发现：以 103~105 TCID50/ 头的剂量鼻内或肌肉注射接种 OUR T88/3 后（每组 6 头）于第 21 天再肌肉注射强毒株 OUR T88/1（104TCID50/ 头），结果103~105 TCID50 的鼻内接种组攻毒后保护率分别为100%、100% 和 66%（4/6），103~104 TCID50 的肌肉注射接种组攻毒后保护率分别为 50%（3/6）和67%（4/6），且各组存活猪中部分出现体温升高、关节肿胀、皮肤坏死斑、结膜炎等慢性非洲猪瘟病症。此外，105 TCID50 肌肉注射组中有 3 头猪因出现非特异性体温升高而终止试验（经排查可能之前有细菌感染）。以上试验说明，自然弱毒株 NH/P68 和 OUR T88/3 仍具有一定毒力，并不太适合作为疫苗种毒。

2.2　基因缺失株

虽然基因 I 型自然弱毒株无法满足疫苗使用条件，但基于此毒株的疫苗研究方向并没有停止。利用基因敲除重组技术，研究者以 NH/P68 或 OURT88/3 为骨架，继续敲除毒力基因或免疫调控基因，分别获得 NH/P68ΔA238L、NH/P68ΔA224L、NH/P68ΔEP153R和 OUR T88/3ΔDP2等多种基因缺失株。结果显示以 NH/P68 为骨架的基因缺失株接种（106 TCID50/ 头，肌肉注射）后出现临床副反应的比例分别是 100%（ΔA238L）和 75%（ΔA224L和 ΔEP153R）， 但 攻 毒（Lisbon 60，105 TCID50/头）后能提供完全保护。以 OUR T88/3 为骨架的缺失株接种（104 TCID50/ 头，肌肉注射）后有 50%（3/6）的猪出现临床副反应（体温升高和关节肿胀），攻毒（OUR T88/1，104 HAD/ 头）后保护率为 67%（4/6）。同时，基于基因 I 型强毒株的基因缺失改造工 作也在不断 尝 试。2017 年，Monteagudo等以 BA71 强毒株（1971 年分离自西班牙巴达霍斯省一发病猪脾脏）为骨架敲除 CD2v 基因（BA71ΔCD2）， 结果发现：BA71ΔCD2 接种家猪（103PFU/ 头，肌肉注射）后无任何临床症状，攻毒（BA71，103HAU/ 头）后保护率为 33%（2/6），但大剂量（3.3×104PFU/ 头或 106PFU/头）免疫 BA71ΔCD2 后能提供完全攻毒保护。为进一步解决 BA71ΔCD2 免疫后个别猪只中存在低载量病毒血症问题，研究者在 BA71ΔCD2 基础之上继续删除了 DP96R 基因（BA71ΔCD2DP96R）和 EP153R 基因（BA71ΔCD2EP153R），结果发现 BA71ΔCD2DP96R 和 BA71ΔCD2EP153R 接种（106PFU/ 头，肌肉注射）后仍存在低载量病毒血症，而且攻毒后（Georgia 2007/1，103HAU/头）保护率分别降为 83%（5/6）和 67%（4/6）。

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