动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测——三聚氰胺

与HPLC法相比，HPCE法兼有电泳和色谱双重技术的特点。HPCE分离效率比HPLC法高，且分离迅速，经相同前处理后，HPCE法比HPLC法对三聚氰胺的分离效果更好；HPCE法样品消耗量比HPLC少；HPCE比HPLC经济环保，HPLC使用的色谱柱价格是毛细管柱价格的几倍。此外，HPLC分析一个样品时，时间越长消耗流动相越多，不仅价格昂贵，而且给环境造成严重的危害。而用HPCE检测一个样品只需1mL缓冲溶液，价廉易得，对环境几乎无污染。但是由于HPCE进样量少、毛细管柱内径小、光程短（CE检测窗口仅为液相检测池的1/20），它的灵敏度受到严重限制，且稳定性也有待提高，所以常规CE检测痕量三聚氰胺还有一定的局限性，只能用于含量较高的样品分析。饶钦雄等利用CE检测鸡蛋中三聚氰胺分离时间约6min，测得的定量限为0.25mg/kg。

为了提高检测灵敏度，常将CE与UVD、DAD等联合进行食品中三聚氰胺残留的痕量检测。Cernova等采用CE-UCD对奶粉中的三聚氰胺进行快速检测，其检测限可达到0.06μg/mL。Yan等提出用CE-DAD检测奶制品、鱼饲料和鱼肉等多种样品中的三聚氰胺残留。Chen等运用CE也建立了一种可同时检测牛奶中三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的灵敏、简单和可靠的分析方法。该方法将CE和DAD联用，在检测系统中添加十二烷基磺酸钠作为筛选介质以增加分离效率。结果表明，根据迁移时间和紫外吸收光谱的不同可实现三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的同时检测，其检测限分别为0.047μg/mL和0.067μg/mL，与HPLC法相比具有分辨率高、分析时间短、所需样品量少、分离效率好等优点。Xia等将毛细管区带电泳（CEZ）法联合二极管陈列检测器（CZE-DAD）建立了一种简单、快速、准确并可同时检测鸡蛋、宠物饲料和奶制品中的三聚氰胺及其类似物的方法。

有报道，与HPLC、荧光光度法和常规的CZE等方法相比，场放大进样-曲带毛细管电泳（FESI-CZE）具有以下明显优势：①灵敏度高。利用在线富集技术可使灵敏度提高近3个数量级，弥补了CE-UVD在测量灵敏度上的缺陷。②抗干扰能力强。在电渗流被抑制的情况下采用电进样方法，对进入毛细管中的成分具有选择性，进样时样品通过电泳作用力引入毛细管中，在正向进样电压下，仅阳离子化合物能进入毛细管中，而基质中一些中性分子或阴离子化合物不能进入或只能少量进入毛细管中，从而克服了样品中存在的部分干扰。③运行成本低，经济环保。利用FESI-CZE技术的优势，李娟等建立了基于水塞联用FESI的CZE检测多种样品中三聚氰胺的分析方法。试验条件：水塞组成为40%乙腈和60%水，水塞进入时间200s，进水压力3kPa。以120mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-10%甲醇为运行缓冲溶液，以0.10mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-20%乙腈为样品基体溶液，进样电压20kV，进样时间80s，分离电压20kV。通过在水塞后电动大体积进样可提高UVD的灵敏度，且采用电动进样，对进入毛细管中的样品具有选择性，样品基质中的一些杂质不能进入柱内，能较好地克服样品基质的影响。在优化试验条件下，与普通的CZE法比较，三聚氰胺的紫外检测灵敏度提高了800倍，检出限由2.0mg/L降至2.5μg/L，线性范围为10~1 000μg/L，添加样品回收率为98%~106%，相对标准偏差均不高于5.1%。

6.3 免疫分析法

免疫分析法在食品安全检测中应用广泛，常被用作快速筛选方法。免疫学法是一种快速检测三聚氰胺的方法，其原理是利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺并进行免疫测定。该法优点是操作简便、分析速度快、可大批量筛选；缺点是与分析样品类似的结构物也可与特异性抗体发生反应，从而产生干扰，在检测过程中存在假阳性问题，对阳性样品需确证方法进行确证。

三聚氰胺事件后，国内外开始研究三聚氰胺完全抗原的合成、多克隆抗体及单克隆抗体的制备等工作。由于三聚氰胺相对分子质量仅为126，是典型的小分子半抗原，用制备的三聚氰胺人工抗原来刺激机体免疫系统产生特异性抗体。首先需要选择合适的三聚氰胺结构类似物作为半抗原进行衍生化，然后采用合适的偶联方法将其与载体蛋白连接得到完全抗原，关键在于不能破坏其表面结构和保持最小的能量转移，这对制备出高灵敏度、高特异性和稳定性的三聚氰胺抗体是至关重要的。目前主要有ELISA法和胶体金免疫层析法。

考虑到三聚氰胺具有环状对称的特殊结构，有3个氨基可供偶联载体，如果采用氨基的反应直接与蛋白连接，则3个氨基都可以同载体蛋白偶合，导致三聚氰胺完全被大分子蛋白包围，这样的抗原不能刺激产生高效价抗体。采用控制三聚氰胺和琥珀酸酐等量反应摩尔比的方法，只将其中1个氨基连接上带有羧基的4碳间隔臂以合成完全抗原。

Wang等建立了一种间接竞争ELISA法，可用于检测猪和鸡的组织及体液中三聚氰胺残留，检测限为50ng/mL，同时用GC-MS法确证，两种方法显示出很好的相关性。Lei等以碳二亚胺法合成三聚氰胺完全抗原，并免疫动物得到特异性多克隆抗体，建立了特异性检测三聚氰胺的间接竞争ELISA法，检测限为5.2ng/mL，定量限为7.6ng/mL。Liu等首先对三聚氰胺进行衍生化合成完全抗原，并免疫动物得到了三聚氰胺的多克隆抗体，建立ELISA法，并对动物肌肉组织中三聚氰胺残留进行检测，检测限为1.8ng/g，样品添加回收率为84.6%~94.3%。

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