动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测——苏丹红

6 检测方法

目前国内外对苏丹红残留的检测主要有薄层色谱法（TLC）、HPLC、HPLC-MS、GC-MS、GPC-LC、极谱法等。

6.1 TLC

TLC是在柱色谱和纸色谱基础上发展起来的分析方法，具有操作简单、成本低、分离效率高的特点，易于普及。主要包括制板、点样、展开、显色和定性定量分析等步骤。

在苏丹红含量测定中，薄板和展开剂的选择在TLC测定中均起着关键作用，主要是两者对样品中的苏丹红分离效果有重要的影响。其中硅胶、氧化铝、聚酰胺等吸附剂因吸附性能良好得到了较好的应用。

窦红等对高效硅胶G板及聚酰胺薄层板分离苏丹红的结果进行比较，发现高效硅胶G板较聚酰胺薄层板分离苏丹红更具优势，分析速度更快，检测灵敏度为0.3mg/kg，分离效果好。王鲜俊等建立了快速分离苏丹红Ⅰ~Ⅳ的TLC，用乙腈-氯仿混合提取辣椒面中的苏丹红，用TLC展开、分离，逐一准确定性苏丹红Ⅰ~Ⅳ，再利用苏丹红Ⅰ~Ⅳ特有的最大吸收波长不同，用比色法定量。回收率为81.9%~95.5%，精密度RSD为4.5%~5.7%，检出限为0.19~0.58μg。比较展开剂甲醇-丙酮-乙酸在硅胶G板、聚酰胺薄层板、硝酸盐-硅胶G板上对苏丹红Ⅰ的展开效果，利用聚酰胺薄层板、甲醇-石油醚-乙酸（3∶1∶1，V/V）做第1次分离，利用硅胶G板、三氯甲烷-石油醚-乙酸（15∶5∶0.1，V/V）2次展开，实现苏丹红Ⅰ~Ⅳ的逐一完全分离，获得了清晰、满意的TLC分离。庞艳玲等用HSG硅胶板，正己烷-乙酸乙酯（100∶0.5，V/V）一次性分离苏丹红，避免了2次展开造成的回收率损失，展开既稳定又迅速，并以紫外可见光光度法进行检测，检测苏丹红Ⅰ~Ⅳ的线性范围分别为0.5~14μg/mL、0.5~10μg/mL、0.5~15μg/mL、0.5~15μg/mL，线性相关系数均为0.999，检出限均为0.05μg/mL。杨林飞等使用正己烷萃取样品、经氧化铝层析柱净化，在硅胶板上展开，紫外灯下显色，将样品与标准品比较，根据斑点Rf值和斑点的大小进行定性和定量，检测了淹鱼块中的苏丹红Ⅰ~Ⅳ，检出限为2μg，回收率为93.2%~95.0%。

6.2 HPLC

由于苏丹红分子中的共轭结构有紫外吸收，因此可以采用HPLC-UV或HPLC-PAD检测。HPLC是目前测定苏丹红最常用的方法，也是欧盟委员会推荐和我国国家标准中使用的方法。

在检测样品中苏丹红时，可根据具体的方法、仪器、试剂等选择合适的波长进行检测。Zhang等在波长200~800nm对苏丹红染料进行紫外扫描，发现苏丹红染料在200~260nm处有最大吸收峰，在450~500nm处也有较大吸收峰。为防止样品溶剂和流动相的吸收峰可能产生的干扰，选择476nm作为最适检测波长。李军等也发现，苏丹红Ⅰ~Ⅳ的最大吸收峰依次在227nm、205nm、227nm、201nm处，第二大吸收峰依次在478nm、491nm、504nm、517nm处，而在低波长200nm处左右干扰较多，选择500nm作为检测波长，并证实在此波长下基本无干扰。甘宾滨等通过对苏丹红Ⅰ~Ⅳ标准品在波长190~800nm处进行扫描，结果表明，苏丹红Ⅰ~Ⅳ的最大吸收波长依次为480nm、498nm、503nm和520nm，并选用478nm作为检测波长。王凤池等利用二极管陈列检测器（DAD）对苏丹红Ⅰ~Ⅳ进行全波长扫描，确定其最大吸收波长依次为479nm、496nm、505nm和517nm，并选用500nm作为检测波长，可同时满足4种物质检测要求。骆和东等将苏丹红各标准溶液进样后在全光谱范围内逐点光谱扫描，利用得到的三维谱图计算出苏丹红Ⅰ~Ⅳ的最大吸收波长依次为506nm、478nm、492nm和518nm。金海涛等利用DAD能够采集化合物的紫外吸收光谱曲线的特点，整合出苏丹红Ⅰ~Ⅳ的等吸收曲线，得出苏丹红Ⅰ~Ⅳ在紫外区的最大吸收波长分别为478nm、520nm、520nm、520nm。国家标准和欧盟委员会使用的检测波长均为苏丹红Ⅰ478nm，苏丹红Ⅱ~Ⅳ520nm。

目前，HPLC中使用的流动相主要有乙腈-甲酸、乙腈-甲酸-丙酮、甲醇-甲酸等。Zhang等选用乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，V/V）作为流动相，能在40min内对苏丹红Ⅰ~Ⅳ进行很好的分离、测定。吴敏等选择0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液做流动相，进行梯度洗脱，有效避开了天然辣椒色素的干扰。杨建荣等认为苏丹红Ⅰ分子结构上的偶氮键可表现为弱碱性，在低pH时，偶氮键的氮原子可吸收少量质子H＋，增强分子极性，洗脱加快，但洗脱液pH在2~4.5时，pH变化对分子极性影响不大，而pH在4.0~6.0时，分子极性随pH变化非常明显。并考察了联苯胺、苏丹红Ⅲ、偶氮蓝、丽春红4R4种偶氮染料对苏丹红Ⅰ色谱分离的干扰，发现以pH为2.65的冰乙酸水溶液和乙腈为流动相进行线性梯度洗脱，可获得很好的分离效果。余孔捷等分别以4%氨水-甲醇溶液、甲醇-水溶液与乙腈-水溶液为流动相进行试验，结果表明，在适当的体积比下，三者均可将苏丹红Ⅰ~Ⅳ完全分开，但采用乙腈-水（93∶7，V/V）为流动相，其灵敏度与分离效果更好。国家标准方法中流动相选用的溶剂乙腈、丙酮易挥发、毒性较大，王艳春采用0.1%甲酸的甲醇溶液作为流动相，不用梯度洗脱，获得了与国家标准方法相似的准确度与精密度。

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