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动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测——苏丹红

日期:08-17 作者:曲志娜 赵思俊等- 小 + 大

6 检测方法

目前国内外对苏丹红残留的检测主要有薄层色谱法(TLC)、HPLC、HPLC-MS、GC-MS、GPC-LC、极谱法等。

6.1 TLC

TLC是在柱色谱和纸色谱基础上发展起来的分析方法,具有操作简单、成本低、分离效率高的特点,易于普及。主要包括制板、点样、展开、显色和定性定量分析等步骤。

在苏丹红含量测定中,薄板和展开剂的选择在TLC测定中均起着关键作用,主要是两者对样品中的苏丹红分离效果有重要的影响。其中硅胶、氧化铝、聚酰胺等吸附剂因吸附性能良好得到了较好的应用。

窦红等对高效硅胶G板及聚酰胺薄层板分离苏丹红的结果进行比较,发现高效硅胶G板较聚酰胺薄层板分离苏丹红更具优势,分析速度更快,检测灵敏度为0.3mg/kg,分离效果好。王鲜俊等建立了快速分离苏丹红Ⅰ~Ⅳ的TLC,用乙腈-氯仿混合提取辣椒面中的苏丹红,用TLC展开、分离,逐一准确定性苏丹红Ⅰ~Ⅳ,再利用苏丹红Ⅰ~Ⅳ特有的最大吸收波长不同,用比色法定量。回收率为81.9%~95.5%,精密度RSD为4.5%~5.7%,检出限为0.19~0.58μg。比较展开剂甲醇-丙酮-乙酸在硅胶G板、聚酰胺薄层板、硝酸盐-硅胶G板上对苏丹红Ⅰ的展开效果,利用聚酰胺薄层板、甲醇-石油醚-乙酸(3∶1∶1,V/V)做第1次分离,利用硅胶G板、三氯甲烷-石油醚-乙酸(15∶5∶0.1,V/V)2次展开,实现苏丹红Ⅰ~Ⅳ的逐一完全分离,获得了清晰、满意的TLC分离。庞艳玲等用HSG硅胶板,正己烷-乙酸乙酯(100∶0.5,V/V)一次性分离苏丹红,避免了2次展开造成的回收率损失,展开既稳定又迅速,并以紫外可见光光度法进行检测,检测苏丹红Ⅰ~Ⅳ的线性范围分别为0.5~14μg/mL、0.5~10μg/mL、0.5~15μg/mL、0.5~15μg/mL,线性相关系数均为0.999,检出限均为0.05μg/mL。杨林飞等使用正己烷萃取样品、经氧化铝层析柱净化,在硅胶板上展开,紫外灯下显色,将样品与标准品比较,根据斑点Rf值和斑点的大小进行定性和定量,检测了淹鱼块中的苏丹红Ⅰ~Ⅳ,检出限为2μg,回收率为93.2%~95.0%。

6.2 HPLC

由于苏丹红分子中的共轭结构有紫外吸收,因此可以采用HPLC-UV或HPLC-PAD检测。HPLC是目前测定苏丹红最常用的方法,也是欧盟委员会推荐和我国国家标准中使用的方法。

在检测样品中苏丹红时,可根据具体的方法、仪器、试剂等选择合适的波长进行检测。Zhang等在波长200~800nm对苏丹红染料进行紫外扫描,发现苏丹红染料在200~260nm处有最大吸收峰,在450~500nm处也有较大吸收峰。为防止样品溶剂和流动相的吸收峰可能产生的干扰,选择476nm作为最适检测波长。李军等也发现,苏丹红Ⅰ~Ⅳ的最大吸收峰依次在227nm、205nm、227nm、201nm处,第二大吸收峰依次在478nm、491nm、504nm、517nm处,而在低波长200nm处左右干扰较多,选择500nm作为检测波长,并证实在此波长下基本无干扰。甘宾滨等通过对苏丹红Ⅰ~Ⅳ标准品在波长190~800nm处进行扫描,结果表明,苏丹红Ⅰ~Ⅳ的最大吸收波长依次为480nm、498nm、503nm和520nm,并选用478nm作为检测波长。王凤池等利用二极管陈列检测器(DAD)对苏丹红Ⅰ~Ⅳ进行全波长扫描,确定其最大吸收波长依次为479nm、496nm、505nm和517nm,并选用500nm作为检测波长,可同时满足4种物质检测要求。骆和东等将苏丹红各标准溶液进样后在全光谱范围内逐点光谱扫描,利用得到的三维谱图计算出苏丹红Ⅰ~Ⅳ的最大吸收波长依次为506nm、478nm、492nm和518nm。金海涛等利用DAD能够采集化合物的紫外吸收光谱曲线的特点,整合出苏丹红Ⅰ~Ⅳ的等吸收曲线,得出苏丹红Ⅰ~Ⅳ在紫外区的最大吸收波长分别为478nm、520nm、520nm、520nm。国家标准和欧盟委员会使用的检测波长均为苏丹红Ⅰ478nm,苏丹红Ⅱ~Ⅳ520nm。

目前,HPLC中使用的流动相主要有乙腈-甲酸、乙腈-甲酸-丙酮、甲醇-甲酸等。Zhang等选用乙腈-0.1%甲酸水溶液(80∶20,V/V)作为流动相,能在40min内对苏丹红Ⅰ~Ⅳ进行很好的分离、测定。吴敏等选择0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液做流动相,进行梯度洗脱,有效避开了天然辣椒色素的干扰。杨建荣等认为苏丹红Ⅰ分子结构上的偶氮键可表现为弱碱性,在低pH时,偶氮键的氮原子可吸收少量质子H+,增强分子极性,洗脱加快,但洗脱液pH在2~4.5时,pH变化对分子极性影响不大,而pH在4.0~6.0时,分子极性随pH变化非常明显。并考察了联苯胺、苏丹红Ⅲ、偶氮蓝、丽春红4R4种偶氮染料对苏丹红Ⅰ色谱分离的干扰,发现以pH为2.65的冰乙酸水溶液和乙腈为流动相进行线性梯度洗脱,可获得很好的分离效果。余孔捷等分别以4%氨水-甲醇溶液、甲醇-水溶液与乙腈-水溶液为流动相进行试验,结果表明,在适当的体积比下,三者均可将苏丹红Ⅰ~Ⅳ完全分开,但采用乙腈-水(93∶7,V/V)为流动相,其灵敏度与分离效果更好。国家标准方法中流动相选用的溶剂乙腈、丙酮易挥发、毒性较大,王艳春采用0.1%甲酸的甲醇溶液作为流动相,不用梯度洗脱,获得了与国家标准方法相似的准确度与精密度。

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