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动物源性食品中霉菌毒素的检测——黄曲霉毒素
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柱后光化学衍生化可使样品液缓慢流经光化学衍生器中，被紫外灯管照射的时间延长，AFB1和AFG1的荧光强度大大提高。史莹华等采用免疫亲和色谱柱纯化，反相HPLC分离，柱后光化学衍生，荧光检测器测定了动物肝脏和肌肉中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量；结果表明4种毒素可在10min内完成分离，线性范围为15～1500pg，线性回归系数大于0.9998；用本方法对动物肝脏和肌肉样品进行了加标回收试验，4种AF的平均回收率为68.7%～83.42%，相对标准偏差（RSD）为3.51%～7.40%，检出限达到265pg/kg。 张春艳等则建立了一种测定饲料及饲料原料中AF的光化学衍生-HPLC方法（图4-4）。试样经甲醇与水的混合液（80:20，V/V）提取，免疫亲和色谱柱净化、浓缩，高效液相色谱分离，在线柱后光化学衍生，荧光检测器检测，外标法定量，在优化的条件下，混合标准工作液中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的浓度分别为0.38～20.00μg/L时，浓度与峰面积线性关系良好，相关系数为0.9996～0.9999；在加标浓度为0.75～20.00μg/kg时，样品平均回收率为81.9%～98.7%，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的检出限分别为0.05μg/kg、0.02μg/kg、0.05μg/kg、0.08μg/kg。 林海丹等报道了一种正相HPLC方法，采用免疫亲和色谱柱纯化，以无水甲醇-无水甲酸-二氯甲烷-正己烷-醋酸乙酯（10:10:200:240:40，V/V）为流动相，不需衍生化，硅胶HPLC柱荧光检测果仁中4种AF，最低检测含量0.1μg/g。 5.2 薄层色谱法（TLC） 虽然薄层色谱法灵敏度相对较差，但提取净化的不断改进和多种展开系统及显色剂的使用使该法具有较好的分离和专一性。其原理是样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层板展开分离后，在365nm紫外灯下，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。Thean等通过改变流动相成分或在不同波段下测AF。Simonella采用乙酸-乙腈-异丙醇-水（1:5:5:39，V/V）为流动相，荧光检测器激发波长352nm，发射波长442nm，可分离测定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。Sobolev等则研发了一种氧化物质（氧化铝）作为新流动相，可对农产品的甲醇-水提取液进行净化处理，样品中加标准品2.5～7.5ng/g，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率为80%～87%，最低检出限为1.0ng/g。 国内外有大量关于建立薄层色谱法测定AFM1的报道。Schuller等建立的方法检出限为0.05μg/kg，回收率为98%；Tuinstra和Bronsgeest将其检出限提高到0.04μg/kg。Stubbfield建立的方法尽管未能达到上述水平，其检出限为0.1μg/kg，回收率仅为80%，但方法简便快速。Lucas等在提取系统中增加了碳酸氢钠，低温离心脱脂肪和蛋白质，最后用三氯甲烷提取AFM1，其回收率达到95%以上，在不使用柱层析净化的条件下，检出限可达到0.1μg/kg，如引入柱层析，则检出限可达到0.02μg/kg。 5.3 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS） 液相色谱-串联质谱法是近年来发展起来的一种仪器检测方法，是一种集高效分离和多组分定性定量分析于一体的系统，它将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度这两种优势结合在一起，成为对很多种类化合物定性定量分析的有力工具。 张浩等采用了液相色谱-质谱联用技术检测花生中的AF，用80%甲醇溶液提取花生中的AF，经免疫小柱净化，以甲醇-乙酸水为流动相，在C18柱上对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2进行分离，采用质谱正离子模式对AF进行检测。结果显示花生中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检测限分别为0.15μg/kg、0.09μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg，回收率为78%～110%，RSD为5.0%～10.3%。 林建忠等使用了液相色谱-离子阱质谱技术检测粮油食品中的AFB1。样品用80%甲醇溶液提取，经自制的净化柱，以甲醇-水为流动相，在C18柱上对样品中的AFB1进行分离，采用质谱正离子模式对AFB1进行检测。方法的线性范围为0.139～1.39μg/L，线性相关系数为0.9998；信噪比（S/N）＝3时，检出限为0.510g/kg。 郑燕等采用了先进的快速液相色谱串联三重四级杆质谱系统，运用二级质谱对花生样品中的4种AFB1、AFB2、AFG1、AFG2进行定性定量分析。样品粉碎后用体积比为84:16的乙腈-水混合液提取，过滤后通过真菌毒素净化柱进样，采用C18柱分离，0.1%甲酸溶液和甲醇做流动相，以60:40比例等度洗脱，质谱在多反应监测（MRM）的正离子模式（图4-5）下进行分析。4种组分在5min内完全分离，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检出限分别是0.012μg/kg、0.009μg/kg、0.013μg/kg、0.007μg/kg，平均加标回收率为80%～95%（表4-2），相对标准偏差小于5%。 |