产品监测
动物源性食品中霉菌毒素的检测——黄曲霉毒素
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4 样品前处理方法 4.1 提取 检测乳及乳制品中的AFM1时，因为其成分复杂，且AFM1在乳及乳制品中仅为痕量，为了减少干扰和误差，必须在定量测定前先对试样进行提取、净化等前处理。Martin等选择了6种提取和净化方法进行比较，结果明确地显示，采用Sep-Pak柱提取和净化牛奶中AFM1的方法在节约操作时间、提高最终提取物的净化程度方面均有极大的优越性。若试样中含有大量的蛋白质，可用Zn（OH）2或Pb（AC）2脱去蛋白质或用丙酮处理以沉淀蛋白质；若试样中含有较多的脂肪，可用正己烷萃取或冷冻离心除去，或在Na2SO4-Al2O3-Na2SO4色谱柱上，用甲苯和三氯甲烷洗脱除去。对于饲料和食用油等，一般使用乙腈除去其中的蛋白质，用正己烷脱脂。 4.2 净化 提取样品中的AF后，还需要一定的前处理方法将提取物中干扰检测的化合物除去，对AF进行富集。最初采用的前处理方法是液-液萃取技术，通过AF在不同极性溶剂中溶解度的差异进行富集。目前多采用固相萃取（SPE）技术，SPE柱中通用的固定相有硅胶、C18键合相、弗罗里硅土以及交联有抗体的免疫亲和色谱（IAC）柱。IAC柱对AF抗原产生特异性吸附作用，而且这种吸附可以被极性有机溶剂洗脱。Sobolev等报道了另一种净化方法，AF经甲醇:水（80:20）提取后，经过氧化铝小柱的单一清洗步骤可被液相色谱仪、荧光检测仪定量测定，此氧化铝小柱对AFB1的检出限为1μg/kg，从花生中得到的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在5.0μg/kg、2.5μg/kg、7.5μg/kg、2.5μg/kg水平上回收率分别为（87.2±2.3）%、（82.0±0.8）%、（80.0±1.8）%和（80.2±2.8）%。 5 检测方法 5.1 高效液相色谱法（HPLC） HPLC是近十几年发展起来的检测AF的方法，主要是用荧光检测器检测，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱，使多种AF同时分离。其原理是将样品中的AF经柱层分离后，通过测量色谱峰的面积计算含其量。其优点是特异性强、灵敏度高、定量准确，可同时分离多种AF，操作简便，定量精确，适于大批量样品的分析。AFB1和AFM1荧光强度较强，但在含水的溶剂中容易发生淬灭，因此一般对AF进行柱前或柱后衍生化以提高待测物的检测灵敏度。 Dunne等采用免疫亲和色谱柱进行前处理，通过溴化吡啶行柱后衍生，用HPLC-荧光检测器进行定量检测。Stroka等为了评价IAC净化-HPLC柱后溴衍生荧光检测法在检测欧盟限量以下AF的有效性，在空白基质中分别添加了2个含量水平的AF：2.4ng/mL总AF（1.0ng/mL的AFB1）和9.6ng/mL总AF（4.0ng/mL的AFB1），AF总量的回收率是71%～92%，其中AFB1的回收率是82%～109%。 美国、加拿大等国实验室则验证了反相HPLC柱后碘衍生化（PCD）检测各个AF含量的方法。9个实验室采用PCD方法，在回收率试验中添加3个含量水平的AF：10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL AF总量。方法的回收率分别为：81%、81%、83%，组内相对标准偏差（RSD）为5.02%～17.22%，组间RSD为4.21%～57.28%。 李佐卿等将免疫亲和色谱柱与三氟乙酸柱前衍生化联用，对蜂蜜和酒中的AF测定建立了方法学，在样品中添加2.5μg/kgAF进行10次测定，平均回收率分别为AFG173.1%、AFB191.6%、AFG290.2%、AFB276.6%；样品10次测定的精密度试验的RSD分别为：AFG111.84%、AFB14.28%、AFG213.41%、AFB214.20%；实际最低检出限为6.25pg/kg。对比柱前和柱后衍生的灵敏度，柱前衍生要比柱后衍生的灵敏度高3倍左右。陈玉波等采用三氟乙酸柱前衍生，利用高效液相色谱同时测定食品中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2（图4-2）。在样品加标回收试验中，样品中AF的添加浓度分别为：AFB1、AFG1 40μg/kg，AFB2、AFG2 10μg/kg，AFM1、AFM2 200μg/kg；结果回收率在78%～102%（图4-3），测定5次的RSD为：AFM1 2.25%、AFG1 3.27%、AFB1 2.93%、AFG2 2.35%、AFB2 2.73%、AFM2 2.77%。结果表明此方法有效，可以将6种AF进行很好的分离，并且对食品中的6种AF能够很好地定量。 |