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动物源性食品中细菌的检测——志贺氏菌

日期:08-10 作者:曲志娜 赵思俊等- 小 + 大

  5.2 生化鉴定
  挑取平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂和半固体各一管。志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层变黄、不产气(福氏志贺氏菌6型可微产气),斜面不变色,不产生硫化氢,无动力;在半固体管内沿穿刺线生长。应进一步做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶,西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵尿素、KCN、水杨苷、七叶苷试验,志贺氏菌属均为阴性反应。必要时应做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌,并以生化试验方法做4个生化群的鉴定。具有以上特性的菌株,疑为志贺氏菌,可做血清凝集试验。
  5.3 血清学分型
  挑取三糖铁琼脂上的培养物,做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查,如果由于K抗原的存在而不出现凝集,应将菌液煮沸后再检查,再用A1、A2、B群、多价D群血清分别试验,如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别检查,确定菌型。福氏志贺氏菌型鉴定的方法:可先用群因子血清检验,再根据群因子血清出现凝集的结果,依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株,可用鲍氏志贺氏菌多价血清1、2、3分别检查,并进一步用1~15各型因子血清确定菌型,如果不是鲍氏志贺氏菌,可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。
  5.4 分子生物学鉴定
  5.4.1 DNA模板的制备
  取增菌液1mL于小离心管中,4000~5000r/min离心5min,弃上清液,向菌沉淀中加入50μL灭菌纯水制成菌悬液,混匀后100℃煮沸10min,12000r/min离心5min,取上清液作为PCR模板。
  5.4.2 引物设计
  上游引物为5′-GTTCCTTGACCGTTCCGATACCGTC-3′;下游引物为5′-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′。扩增片段长度为629bp。
  5.4.3 PCR反应体系
  反应体积25μL:10×buffer2.5μL,TaqDNA聚合酶(2U/μL)0.5μL,MgCl2溶液(25mmol/L)3μL,dNTP(25mmol/L)1μL,ddH2O14μL,上游引物(10μmol/L)1μL,下游引物(10mol/L)1μL,模板2μL。
  5.4.4 PCR反应参数
  95℃预变性5min;95℃变性15s,65℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃后延伸5min。4℃保存。
  注:PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。
  5.4.5 电泳
  用核酸电泳缓冲液(TAE)制备1.8%~2.0%的琼脂糖凝胶,取5μLPCR扩增产物,分别和2μL上样缓冲液混合进行点样,用DNA分子量标记物做参照,3~5V/cm恒压电泳,电泳20~40min,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
  5.4.6 结果判定
  在阴性对照未出现条带、阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下,如待测样品未出现629bp大小的扩增带,则判为阴性;如待测样品出现629bp大小的扩增带,则判为阳性。
  如果阴性对照和(或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带,则本次检测结果无效,应重新试验。

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