产品监测
动物源性食品中细菌的检测——志贺氏菌
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5.2 生化鉴定 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和半固体各一管。志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层变黄、不产气（福氏志贺氏菌6型可微产气），斜面不变色，不产生硫化氢，无动力；在半固体管内沿穿刺线生长。应进一步做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶，西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵尿素、KCN、水杨苷、七叶苷试验，志贺氏菌属均为阴性反应。必要时应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌，并以生化试验方法做4个生化群的鉴定。具有以上特性的菌株，疑为志贺氏菌，可做血清凝集试验。 5.3 血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查，再用A1、A2、B群、多价D群血清分别试验，如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查，确定菌型。福氏志贺氏菌型鉴定的方法：可先用群因子血清检验，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏志贺氏菌多价血清1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清确定菌型，如果不是鲍氏志贺氏菌，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。 5.4 分子生物学鉴定 5.4.1 DNA模板的制备 取增菌液1mL于小离心管中，4000～5000r/min离心5min，弃上清液，向菌沉淀中加入50μL灭菌纯水制成菌悬液，混匀后100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清液作为PCR模板。 5.4.2 引物设计 上游引物为5′-GTTCCTTGACCGTTCCGATACCGTC-3′；下游引物为5′-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′。扩增片段长度为629bp。 5.4.3 PCR反应体系 反应体积25μL：10×buffer2.5μL，TaqDNA聚合酶（2U/μL）0.5μL，MgCl2溶液（25mmol/L）3μL，dNTP（25mmol/L）1μL，ddH2O14μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10mol/L）1μL，模板2μL。 5.4.4 PCR反应参数 95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min。4℃保存。 注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。 5.4.5 电泳 用核酸电泳缓冲液（TAE）制备1.8%～2.0%的琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。 5.4.6 结果判定 在阴性对照未出现条带、阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品未出现629bp大小的扩增带，则判为阴性；如待测样品出现629bp大小的扩增带，则判为阳性。 如果阴性对照和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，则本次检测结果无效，应重新试验。 |