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动物源性食品中寄生虫的检测——旋毛虫

日期:08-05 作者:曲志娜 赵思俊等- 小 + 大

(1)抗原制备 试验中所用抗原的质量决定ELISA的特异性和敏感性。用L1(1期)幼虫制备的特异性抗原带有TSL-1抗原表位,可被旋毛虫抗原所识别。该抗原可用来检测感染旋毛虫的动物,因所有旋毛虫均有此类抗原。该旋毛虫抗原制备采用旋毛虫(Tspiralis),由国际旋毛虫保种中心(在意大利罗马)命名为T1。该旋毛虫作为重要诊断抗原在鼠体内需要经过一系列的发育阶段。

制备ELISA抗原,将去掉皮和内脏并已磨碎的旋毛虫(T1),感染鼠胴体,用1%胃蛋白酶和1%盐酸消化3h(37℃)后回收旋毛虫的肌肉期幼虫。幼虫用含有500U双抗的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM,含青链霉素各500U/mL)浸洗3次,每次20min,并放在DMEM完全培养基中(即DMEM中补加下列成分:HPES10mmol/L,谷氨酰胺2mmol/L,丙酮酸1mmol/L和各50U的双抗)。并在10%二氧化碳的环境下置37℃培养18~20h。回收的培养物滤去虫体,滤液在3ku分子量的滞留压力下浓缩。回收的分泌性抗原约含25种蛋白质成分,大部分蛋白质都含有旋毛虫肌幼虫糖抗原表位(TSL-1)。

抗原质量标准与ELISA的特异性具有至关重要的关系。应通过显微镜分阶段观察或通过样品的平板检测细菌生长情况。对于有细菌生长的平板应予废弃。幼虫最长保存时间为20h,超过此时限会由于菌体抗原渗出虫体遭到破坏而降低特异性。用来做鉴定的抗原在波长280/260mm处的吸光度值应大于10。体外培养获得的旋毛虫幼虫的抗原应通过已知阴性、阳性血清反应测定。

(2)试验程序

①用包被缓冲液(50mmol/L碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液,pH9.6)将旋毛虫分泌性抗原稀释至5μg/mL,每孔加入100μL抗原稀释液包被96孔微量滴定板。37℃放置60min或4℃过夜。

②用洗液[含50mmol/L Tris,pH7.4,150mmol/L氯化钠,5.0%脱脂干乳和1.0%聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100)]将板冲洗3次。每次洗涤后,将滴定板晾干。

③用洗液1∶10或1∶100稀释猪血清。另外还可用全血和组织液替代血清。加100μL稀释的猪血清到抗原包被孔。每板设与试验血清相同稀释度的已知阳性和阴性血清做对照。室温下孵育30min。

④按②洗涤3次。

⑤用洗液将兔抗猪IgG过氯化物酶结合物做(0.1mg/mL)1∶1000稀释,每孔加入100μL。室温下孵育30min。

⑥按②洗涤3次;最后1次用蒸馏水冲洗。

⑦加入100μL适当的过氧化物酶底物[如5′-对氨基水杨酸(08mg/mL)含0.005%过氧化氢酶解底物,pH5.6~6.0]。

⑧5~15min后,在酶标仪上以450nm波长测定微量板的OD值,当该值达到混合阴性对照血清值的4倍判为阳性,达3倍则判为可疑。阻断值受猪品种影响。

商业用的ELISA是双抗体夹心ELISA法,它使用过氧化物酶标记的抗猪血清,测定时间短,所需时间不应超过1h。

5.2.1.4 免疫胶体金技术

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金,将胶体金标记ES重组抗原溶液用X-only单向喷点仪均匀喷洒于玻璃棉上,将单克隆抗体及羊抗猪LgG分别点射于印膜上形成阳性与阴性两条线,检测时取被检猪的肌肉组织1∶5或1∶20倍稀释匀浆或剪碎,试纸条测试端浸入匀浆组织液(或1∶5或1∶20倍稀释的被检猪血清)10s或20s后取出平放,在5min内判定检测结果,出现1条反应线即阳性线和对照线时判为阳性,只出现1条对照线时判为阴性。检测过程中如无对照线出现时判试纸条失效。

5.3 PCR

PCR是20世纪80年代中期发展起来的一种在体外迅速大量扩增特异性DNA的新技术,它具有高度的灵敏性和特异性。目前,Caballero等用PCR对试验感染小鼠进行旋毛虫病早期诊断,结果最早在感染后第3天检测到旋毛虫DNA,在第3~17天,33只试验鼠血样中均检测到旋毛虫DNA。根据旋毛虫幼虫1.6kb基因序列而设计合成引物,以PCR检测含鼠旋毛虫幼虫及纯幼虫。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,可见扩增出了特异的670bp与500bp大小的DNA带,而正常肌肉对照未见扩增出此带。本法可检测0.01条幼虫产物,具有高敏感性和特异性。但由于旋毛虫本身及其在宿主体内寄生部位的特殊性,难以在生前从被感染动物的血清、组织液中扩增到旋毛虫DNA,故利用PCR基因检测技术对旋毛虫病生前检测受到限制。

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