动物源性食品中寄生虫的检测——旋毛虫
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（1）抗原制备 试验中所用抗原的质量决定ELISA的特异性和敏感性。用L1（1期）幼虫制备的特异性抗原带有TSL-1抗原表位，可被旋毛虫抗原所识别。该抗原可用来检测感染旋毛虫的动物，因所有旋毛虫均有此类抗原。该旋毛虫抗原制备采用旋毛虫（Tspiralis），由国际旋毛虫保种中心（在意大利罗马）命名为T1。该旋毛虫作为重要诊断抗原在鼠体内需要经过一系列的发育阶段。 制备ELISA抗原，将去掉皮和内脏并已磨碎的旋毛虫（T1），感染鼠胴体，用1％胃蛋白酶和1％盐酸消化3h（37℃）后回收旋毛虫的肌肉期幼虫。幼虫用含有500U双抗的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基（DMEM，含青链霉素各500U/mL）浸洗3次，每次20min，并放在DMEM完全培养基中（即DMEM中补加下列成分：HPES10mmol/L，谷氨酰胺2mmol/L，丙酮酸1mmol/L和各50U的双抗）。并在10％二氧化碳的环境下置37℃培养18～20h。回收的培养物滤去虫体，滤液在3ku分子量的滞留压力下浓缩。回收的分泌性抗原约含25种蛋白质成分，大部分蛋白质都含有旋毛虫肌幼虫糖抗原表位（TSL-1）。 抗原质量标准与ELISA的特异性具有至关重要的关系。应通过显微镜分阶段观察或通过样品的平板检测细菌生长情况。对于有细菌生长的平板应予废弃。幼虫最长保存时间为20h，超过此时限会由于菌体抗原渗出虫体遭到破坏而降低特异性。用来做鉴定的抗原在波长280/260mm处的吸光度值应大于10。体外培养获得的旋毛虫幼虫的抗原应通过已知阴性、阳性血清反应测定。 （2）试验程序 ①用包被缓冲液（50mmol/L碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.6）将旋毛虫分泌性抗原稀释至5μg/mL，每孔加入100μL抗原稀释液包被96孔微量滴定板。37℃放置60min或4℃过夜。 ②用洗液[含50mmol/L Tris，pH7.4，150mmol/L氯化钠，5.0％脱脂干乳和1.0％聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100）]将板冲洗3次。每次洗涤后，将滴定板晾干。 ③用洗液1∶10或1∶100稀释猪血清。另外还可用全血和组织液替代血清。加100μL稀释的猪血清到抗原包被孔。每板设与试验血清相同稀释度的已知阳性和阴性血清做对照。室温下孵育30min。 ④按②洗涤3次。 ⑤用洗液将兔抗猪IgG过氯化物酶结合物做（0.1mg/mL）1∶1000稀释，每孔加入100μL。室温下孵育30min。 ⑥按②洗涤3次；最后1次用蒸馏水冲洗。 ⑦加入100μL适当的过氧化物酶底物[如5′-对氨基水杨酸（08mg/mL）含0.005％过氧化氢酶解底物，pH5.6～6.0]。 ⑧5～15min后，在酶标仪上以450nm波长测定微量板的OD值，当该值达到混合阴性对照血清值的4倍判为阳性，达3倍则判为可疑。阻断值受猪品种影响。 商业用的ELISA是双抗体夹心ELISA法，它使用过氧化物酶标记的抗猪血清，测定时间短，所需时间不应超过1h。 5.2.1.4 免疫胶体金技术 采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，将胶体金标记ES重组抗原溶液用X-only单向喷点仪均匀喷洒于玻璃棉上，将单克隆抗体及羊抗猪LgG分别点射于印膜上形成阳性与阴性两条线，检测时取被检猪的肌肉组织1∶5或1∶20倍稀释匀浆或剪碎，试纸条测试端浸入匀浆组织液（或1∶5或1∶20倍稀释的被检猪血清）10s或20s后取出平放，在5min内判定检测结果，出现1条反应线即阳性线和对照线时判为阳性，只出现1条对照线时判为阴性。检测过程中如无对照线出现时判试纸条失效。 5.3 PCR PCR是20世纪80年代中期发展起来的一种在体外迅速大量扩增特异性DNA的新技术，它具有高度的灵敏性和特异性。目前，Caballero等用PCR对试验感染小鼠进行旋毛虫病早期诊断，结果最早在感染后第3天检测到旋毛虫DNA，在第3～17天，33只试验鼠血样中均检测到旋毛虫DNA。根据旋毛虫幼虫1.6kb基因序列而设计合成引物，以PCR检测含鼠旋毛虫幼虫及纯幼虫。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出了特异的670bp与500bp大小的DNA带，而正常肌肉对照未见扩增出此带。本法可检测0.01条幼虫产物，具有高敏感性和特异性。但由于旋毛虫本身及其在宿主体内寄生部位的特殊性，难以在生前从被感染动物的血清、组织液中扩增到旋毛虫DNA，故利用PCR基因检测技术对旋毛虫病生前检测受到限制。 |