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动物源性食品中细菌的检测——金黄色葡萄球菌

日期:07-11 作者:曲志娜,赵思俊等- 小 + 大

  培养:将接种样液的测试片的透明面朝上水平置于培养箱内,堆叠片数不超过20片,在(36±1℃条件下培养(24±2)h。
  确认反应:如果测试片上没有菌落生长或菌落全部是紫红色(典型的金黄色葡萄球菌特征),无须进行确认;如果测试片上出现黑色、蓝绿色菌落或紫红色菌落不明显,需使用PetrifilmTM确认反应片做进一步确认。
  将上层膜掀起,将确认反应片置入测试片的培养范围内,再将上层膜放下覆盖在确认反应片上,用手指滑动的方式轻轻将测试片与确认反应片压紧,包括确认反应片的边缘,此步骤可使测试片与PetrifilmTM确认反应片紧密接触并除去气泡,最后把插入确认反应片的测试片放在(36±1)℃条件下培养1~3h。
  结果计算与报告:紫红色的菌落直接计数为金黄色葡萄球菌;需要使用确认反应片做确认时,计数有粉红色晕圈的菌落。没有粉红色晕圈的菌落不是金黄色葡萄球菌,不应被计数。如果整个培养面呈粉红色而没有明显的晕圈,说明金黄色葡萄球菌大量存在,结果记录为“多不可计”。
  菌落计数。培养结束后立即计数,可目视或用菌落计数器来计数,放大镜可辅助计数;选取金黄色葡萄球菌菌落数在15~150个的测试片,计数菌落数,乘以相对应的稀释倍数报告之;如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15个,则计数稀释度最低的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之;如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之;如果最高稀释度的菌落数大于150个,计数最高稀释度的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之。报告单位以CFU/g(mL)表示。
  4.3 ELISA方法检验金黄色葡萄球菌肠毒素
  (1)原理 本方法可用A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒完成。本方法测定的基础是ELISA。96孔酶标板的每一个微孔条的A~E孔分别包被了A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素抗体,H孔为阳性质控,已包被混合型金黄色葡萄球菌肠毒素抗体,F和G孔为阴性质控,包被了非免疫动物的抗体。样品中如果有金黄色葡萄球菌肠毒素,游离的金黄色葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加入反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止了酶反应;以450nm波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比。
  (2)仪器和设备 冰箱、恒温培养箱、振荡培养箱或普通培养箱、电子天平(0.01g)、均质器、离心机、离心管(50mL)、滤器(0.2μm)、微量加样器、微量多通道加样器、自动洗板机(可选择使用)、酶标仪。
  (3)试剂和材料 A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒,pH试纸(3.5~8.0),025mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH8.0),磷酸盐缓冲液(pH7.4),庚烷,10%次氯酸钠溶液,肠毒素产毒培养基,营养琼脂。
  (4)检测步骤
  从分离菌株培养物中检测金黄色葡萄球菌肠毒素方法:将待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18mm×18mm),于37℃培养24h,用5mL生理盐水洗下菌落,倾入60mL产毒培养基中,37℃振荡培养48h,振速为100次/min,吸出菌液离心,8000r/min离心20min,100℃加热10min,取上清液,取100L稀释后的样液进行试验。
  从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法:对于乳和乳粉样品,可将25g乳粉溶解到125mL0.25mol/L的Tris缓冲液(pH8.0)中,混匀后同液体乳一样按以下步骤制备。将乳于15℃下3500g离心10min。将表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂乳。用蒸馏水对其进行稀释(1∶20)。取100μL稀释后的样液进行试验。
  对于脂肪含量不超过40%的食品,称取10g样品绞碎,加入pH7.4的PBS液15mL进行均质。振摇15min。于15℃下3500g离心10min。必要时,移去上面脂肪层。取上清液进行过滤除菌。取100μL的滤出液进行试验。
  对于脂肪含量超过40%的食品,称取10g样品绞碎,加入pH7.4的PBS液15mL进行均质。振摇15min。于15℃下3500g离心10min。吸取5mL上层悬浮液,转移到另外一个离心管中,再加入5mL的庚烷,充分混匀5min。于15℃下3500g离心5min。将上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷。将下部水相层进行过滤除菌。取100μL的滤出液进行试验。

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