动物源性食品中寄生虫的检测——弓形虫
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4.2.6 乳胶凝集试验（LAT） 以乳胶微粒作为载体的凝集反应，于恩庶等指出LAT用于检测弓形虫感染初期敏感性好。陈亚棠等认为LAT具有操作简单、采血量少和结果稳定而易于观察等优点，适用于大规模血清流行病学调查。伦敦公共卫生实验室把LAT作为常规过筛试验，假阳性率为1%～2%。江涛采用重组弓形虫微线体蛋白3的乳胶凝集试验（rMIC3-LAT）检测人工感染弓形虫试验猪血清特异性抗体的动态变化，同时与IHAT和ELISA做比较，发现LAT的敏感性较IHAT高，检测抗体的时间较ELISA早，并且检测的时间范围较宽。 总之，LAT具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简单、结果易于判定的特点，而且既可用于早期诊断，又可用于抗体的监测，适合现场检测和大规模血清流行病学调查。但判断有一定的主观因素，不能做定量分析。 4.2.7 补体结合试验（CFT） Nicolan和Rovello首次应用该试验诊断弓形虫病。Ondriska等认为其是检测弓形虫感染的可靠指标，特别是在检测个体样品时，如果CFT与IgM或IgA抗体水平相结合或者与亲和IgG抗体水平相结合能够更客观地反映病程。该试验对牛、山羊等某些动物不适用。 4.3 分子生物学诊断 目前，国内外已经建立多种弓形虫病基因诊断方法，主要有PCR与DNA探针技术，具有操作简单、快速、特异和灵敏等优点。 4.3.1 PCR 应用于PCR检测的靶基因主要有B1基因、P30（SAG1）基因、ITS1、rDNA（18S rRNA和5.8S rRNA）及529bp重复序列。B1基因是一种多拷贝基因，且序列高度保守，是目前最为理想的检测基因。Burg等于1989年首次以B1基因作为PCR的靶基因，已成功地从细胞裂解物中检出仅含的1条弓形虫；李建等选择B1基因作为靶基因，将PCR检测全血DNA与ELISA检测血清IgM进行比较，结果PCR阳性的最早检出时间早于ELISA，可用于弓形虫病的早期诊断。谢德华等以弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区（ITS1）序列建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法，该方法最低能检测到10条弓形虫速殖子的DNA，且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应。余莉等用529bp重复序列作为靶基因，建立猪肉PCR检测方法，每10g猪肉能检测100个速殖子，而B1基因每10g猪肉能检测1000个速殖子，其敏感性是B1基因的10倍。 为提高试验的敏感性和特异性，在普通PCR基础上，发展了巢式PCR、套式PCR、RT-PCR等。Johnson等根据SAG1基因设计了两对引物，先用DS29和DS30引物对扩增，再用DS38和DS39引物对进行第二次扩增，其敏感性可达0.05pg弓形虫DNA。陈晓光等建立巢式PCR，最低可检测出1pg的弓形虫DNA；Sawa等用巢式PCR检出了0.05pg的P30DNA，理论上相当于一个速殖子的基因组DNA；Ana Hurtado等建立的单管套式PCR检测方法，所得的结果与用IFAT所得的结果基本一致，而且敏感性达到0.1pg弓形虫RH株DNA。 4.3.2 环介导等温扩增（LAMP） LAMP是Notomi等于2000年报道的一种新的核酸扩增技术，它通过BstDNA聚合酶进行链的自动循环代替DNA经典合成。LAMP只需要在等温条件下（63～65℃），30～60min就可以合成10～20μg的DNA，与PCR相比，不需要染色，肉眼就可以观察结果。杨秋林等根据弓形虫特异性基因B1的基因序列设计一套用于LAMP的特异性引物，试验显示出较好的特异性与敏感性。Zhang等用弓形虫的529bp的高度保守的重复序列设计LAMP引物，敏感性达85.7%，而PCR敏感性为76.9%。Krasteva等运用弓形虫单拷贝基因SAG1设计LAMP引物扩增弓形虫DNA，与PCR相比更敏感。Sotiriadou等用LAMP扩增弓形虫B1和OWP基因检测水体弓形虫，可以检测到0.1个速殖子。 4.3.3 DNA探针 Blanco等建立了RH株弓形虫基因文库，筛选出一个重复片段，用32P标记作为探针，斑点杂交可检测到80pg以上纯化弓形虫DNA。夏爱娣等也建立了弓形虫人株（ZS-2）株弓形虫基因文库，筛选了一个1.1kb特异性DNA片段并用32P标记作为探针检测弓形虫，敏感度为500pg纯化弓形虫DNA。Angel等采用ABGTg7标记的探针杂交检测急性弓形虫脑炎病人DNA，敏感性为66.7%。目前用于弓形虫检测的探针多为特异性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探针，虽然敏感性高，但其制备需要一定条件，且费用较高，不易推广。 分子生物学诊断是非常敏感和特异的方法，但其对试验环境和操作者技术要求高，有许多因素影响其结果，且费用较高不利于普及。在实际操作中还是以血清学检测为主。 |