动物源性食品中寄生虫的检测——弓形虫
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4.2 血清学检测 血清学检测由于快速、准确、经济，已成为目前应用广泛、发展快速的检测弓形虫感染的方法。主要方法包括：染色试验、间接红细胞凝集试验、ELISA、间接免疫荧光试验、补体结合试验和免疫胶体金技术等。 4.2.1 染色试验（DT） 弓形虫速殖子、补体辅助因子和待检血清一起置37℃孵育1h，然后以亚甲蓝染色，当有特异性抗体存在时，寄生虫膜通透性增加，胞质流出，速殖子不能与染料结合而呈无色；当无特异性抗体存在时，速殖子能吸附染料而呈蓝色。该方法为经典的弓形虫病血清学检测，具有良好的特异性、敏感性和重复性。但该方法由于在检查时必须使用活的、有毒力的速殖子而存在巨大的危险性，应用受到一定的限制。 4.2.2 间接红细胞凝集试验（IHAT） 将速殖子可溶性抗原吸附于红细胞表面，再与相应的抗体发生反应，通过抗原与抗体的特异性反应，使红细胞间接凝集。Jacob和Lunde于1957年首先将该法应用于弓形虫病检测。我国于恩庶于1979年将IHAT应用于猪弓形虫病的检测。1982年，中国农业科学院兰州兽医研究所研制出IHAT诊断试剂盒。Wilson等应用ELISA、IHAT和IFAT三种试剂盒，对100份血清标本进行检测以后认为，IHAT对急性感染早期血清缺乏敏感性。崔兆君等认为IHAT特异性高、假阳性率低、诊断价值高和操作简便，缺点是敏感性不如ELISA，重复性较差，致敏红细胞不稳定，阳性判断标准带有一定的主观性。 4.2.3 ELISA 用速殖子可溶性抗原包被酶标板，加入待检血清，再滴加酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗绵羊IgG），利用酶的催化作用和底物放大反应原理，对待检抗体进行定性和定量分析。1976年，Voller等首次将该方法应用于检测弓形虫特异性抗原，获得与DT和IHAT良好的符合率，且敏感性强。Peter等用弓形虫速殖子粗体抗原建立间接ELISA检测猪弓形虫病，以DT方法做比较，结果间接ELISA的敏感性和特异性都为94%。 近年来随着分子生物学技术的应用，重组抗原取代天然抗原作为诊断抗原，省去抗原制备的繁琐过程，从而达到经济、特异和安全的目的。Redlich等用表达的融合蛋白GRA6-GST建立ELISA，其敏感性可达98%；Aubert等将重组的棒状体蛋白1（ROP1）、表面抗原蛋白（P25和P35）混合建立ELISA，用于弓形虫IgM的检测，其敏感性、特异性及符合率分别为93.1%、95.0%和94.5%，可用于弓形虫早期诊断；Huang等以表面蛋白P22（SAG2）建立ELISA，与IHAT做比较，发现该方法特异性强、敏感性高。国内吕斌等以重组的P35-GST建立了检测人血清的IgM的ELISA，该方法能区分弓形虫病的急性感染和慢性感染。张东林等建立了可检测多种动物弓形虫抗体的AG-ELISA，检测了人工感染的猪和自然感染的4种动物（猪、牛、猫和犬）的血清中抗弓形虫抗体，表明AG-ELISA阳性检出的时间比改良凝集试验方法早，其检出率、敏感性及准确度等均优于乳胶凝集试验。 总之，该方法操作易自动化，具有高度特异性和敏感性，结果可定量，适于批量样品的检测，有很好的推广应用价值。 4.2.4 间接荧光抗体试验（IFAT） 以速殖子为抗原，与被检稀释血清一起孵育，加入荧光素（异硫氰酸荧光素）标记的二抗，在荧光显微镜下观察结果。Miller等采用此法检测经免疫组化和病原学分离的28例阳性和46例阴性者的血清，发现其敏感性和特异性分别为96.4%和67.3%。该方法用于弓形虫早期感染中IgM和IgG抗体检测，具有较高敏感性、特异性和重现性等优点，但类风湿因子可引起IgM抗体的假阳性反应。因试验需要荧光显微镜观察，限制了该法的广泛使用。 4.2.5 免疫胶体金技术（ICT） ICT是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。王艳华等建立ICT检测弓形虫血清，并与IHAT做比较，结果符合率为82.5%，ICT比IHAT能提前2d检测到弓形虫抗体，说明ICT的敏感度高于IHAT。日本带广畜产大学以重组SAG2抗原建立快速免疫层析试验检测猫体内刚地弓形虫抗体。结果证明ICT是一种快速、简便、敏感（敏感度可达到ELISA的水平）和特异的，适用于现场诊断弓形虫特异性抗体的有效工具。 |