动物源性食品中寄生虫的检测——囊尾蚴
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（1）红细胞鞣化和致敏 取醛化红细胞用0.15mol/L的PBS（pH7.2）离心洗涤2次，沉淀用PBS配成2.5％悬液；加等量1∶2000鞣酸溶液（鞣酸不同批号，质量相差较大必须预试测定适宜浓度）37℃孵育20min，经常摇动；离心去上清液，用PBS洗1次，再用0.15mol/L的PBS（pH6.4）配成10％悬液；每份悬液加等量适当稀释的抗原液，置于37℃水浴箱中30min（每5min振动1次），离心去上清液，用PBS（pH7.2）洗2次，再用含1％正常兔血清（NRS）和10％蔗糖缓冲液配成5％细胞悬液。加0.1％叠氮化钠防腐，存于4℃或减压冻干备用，每批致敏细胞均需用已知阳性和阴性血清滴定灵敏度或特异性。阳性滴度在1∶640以上，阴性血清不出现反应者可用。 （2）微量血凝试验 在U形（或V形）微量血凝板上，将被试血清用1％NRS或牛血清白蛋白（BSA）生理盐水做倍比系列稀释，每孔含稀释血清0.05mL。每孔加0.01mL致敏红细胞悬液（可用标定过的注射器针头滴加），充分振荡摇匀，加盖于室温静置1～2h读取结果。 根据红细胞在孔底的沉积类型而定。“－”，红细胞沉于管底，呈圆点形，外周光滑；“±”，红细胞沉于管底，周围不光滑或中心有白色小点；“＋”，红细胞沉积范围很小，呈较明显的环形圈；“＋＋”，红细胞沉积范围较小，其中可出现淡淡的环形圈；“＋＋＋”，红细胞布满管底，呈毛玻璃状；“＋＋＋＋”，红细胞呈片状凝集或边缘卷曲。呈明显阳性反应（＋）的最高稀释度为该血清的滴度或效价。间接红细胞凝集试验检测脑脊液或血清抗体滴度大于正常参考值上限，即血清凝集滴度＜1∶8，脑脊液＜1∶2，可诊断为脑囊虫病，阳性率为78％～91.4％。 5.3.2 酶联免疫吸附试验 目前尾蚴病最可靠的诊断方法是酶联免疫吸附技术。早期建立的酶联免疫吸附试验（ELISA）被广泛地应用在猪囊尾蚴病的诊断上。在该基础上又发展了斑点酶联免疫吸附试验、生物素亲和素酶联免疫吸附试验、抑制性酶联免疫吸附试验等。此外，还成功开发了采用酶联免疫原理和胶体金层析技术制备的囊尾蚴病快速诊断金标试纸条技术。酶联免疫吸附试验检出率高、特异性强、稳定性好，已经被列入我国动物检疫规程，具体操作步骤如下： （1）被检猪全血血片将10cm×1cm普通滤纸条的一端标记被检猪号码，另一端吸取被检猪任何部位血液1～2滴，于室内阴干后，置于4℃冰箱内（可保存6个月）。 （2）用抗原包被液洗涤ELISA反应板各孔3次。以抗原包被液将抗原按使用说明书稀释至工作浓度加至ELISA反应板各孔内，每孔0.1mL，加盖后置于室温（11～29℃）过夜。 （3）用力甩净包被过夜的ELISA反应板孔内的抗原包被液，每孔加入洗涤液，浸泡3min后，用力甩去洗涤液，并用滤纸吸去残留的洗涤液和驱除孔内气泡，重新加入洗涤液，按同样方法共洗涤3次，即3×3min冲洗。 （4）将被检血片、标准阴性血片及标准阳性血片均剪成1cm×1cm大小，分别置于青霉素瓶内，每1cm×1cm血片加入稀释液0.3mL，浸泡20min，即血片变白后即可。 （5）每份被检血片浸液加2孔，每孔0.1mL。标准阴性、标准阳性对照孔加相应血片浸液2孔，每孔0.1mL。空白对照孔加稀释液2孔，每孔0.1mL。加样后加盖，于室温（11～29℃）放置30min后按（2）方法用洗涤液洗涤。 （6）辣根过氢化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A（HRP-SPA）标准物按使用说明书以稀释液稀释至工作浓度。被检孔、标准阴性孔和标准阳性孔，每孔加HRP-SPA标记物0.1mL。空白对照孔亦加0.1mL。加完后加盖，于室温（11～29℃）放置30min后按（2）方法用洗涤液洗涤。 （7）每孔加现配制的底物溶液0.1mL，于室温（11～29℃）放置10min。 |