动物源性食品中细菌的检测——布鲁氏菌

（6）结果判定 当阳性血清出现完全凝集（＋＋＋＋），而阴性血清无凝集（－）、抗原对照无自凝（－）现象时，试验成立，按以下对试验结果进行判定：

①受检血清出现“＋＋”及以上凝集现象时，判定为阳性。

②受检血清出现“＋”凝集现象时，判定为可疑。

③受检血清出现“－”时，判定为阴性。

4.3.2 虎红平板凝集试验（RBPT）

根据《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646—2018）。其方法是取被检血清、布鲁氏菌标准阴/阳性血清和布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原各25μL，滴加于玻璃板4cm2方格内，用灭菌牙签或混匀棒快速混匀血清和抗原，混匀后4min，在自然光下观察。在标准阴性血清不出现凝集、标准阳性血清出现凝集时，试验成立，方可对受检血清进行判定。出现肉眼可见凝集现象者判定为阳性（＋），无凝集现象且反应混合液呈均匀粉红色者判定为阴性（－）。该试验反应敏感、稳定，特异性优于试管凝集反应，这种试验已在许多国家推广使用，常作为常规诊断方法之一。

4.3.3 全乳环状试验

全乳环状试验用于奶牛及奶山羊布鲁氏菌病检疫，以监视无病畜群有无该病感染，也可用于个体动物的辅助诊断。按《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646—2018）和《布氏杆菌检疫技术规范》（SN/T1088—2010）进行。操作步骤如下：

（1）取新鲜全乳样品1mL加入灭菌玻璃试管中，取布鲁氏菌全乳环状试验抗原50μL加入乳样中，充分振荡混合均匀。

（2）置37～38℃水浴中孵育60min，小心取出试管，勿振荡，立即进行判定。

（3）结果判定：判定时不论哪种抗原，均按乳脂的颜色和乳柱的颜色进行判定。

强阳性反应（＋＋＋）：乳柱上层的乳脂形成明显红色或蓝色的环带，乳柱呈白色，分界清楚。

阳性反应（＋＋）：乳脂层的环带虽呈红色或蓝色，但不如“＋＋＋”显著，乳柱微带红色或蓝色。

弱阳性反应（＋）：乳脂层环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深。

疑似反应（±）：乳脂层环带不明显，并与乳柱分界模糊不清，乳柱带有红色或蓝色。

阴性反应（－）：乳柱上层无任何变化，乳柱呈均匀浑浊的红色或蓝色。

4.3.4 间接酶联免疫吸附试验

间接酶联免疫吸附试验是检测布鲁氏菌病的国际贸易指定试验，操作步骤如下：

（1）用特异性抗原包被96孔酶标板，于4℃温孵18h，可直接使用，也可于－20℃冻存，用前于37℃30～45min解冻。

（2）用0.01mol/L的pH72磷酸盐缓冲体系（PBST）洗涤微量板4次以去除未吸附的抗原。

（3）第一列双孔加入1∶20稀释的强阳性、弱阳性、阴性对照血清和1×样品稀释液100μL作为平行对照，从第二列起单孔加入同等稀释度的被检血清100μL。室温（18～28℃）下孵育30min。

（4）用PBST洗涤微量板4次以除去其他未结合的血清，在干净的吸水纸巾上拍打除去残留的洗涤液；然后每孔加入100μL的用PBST稀释的酶标抗体，室温（18～28℃）下孵育30min。

（5）洗涤4次除去其他未结合的物质，在干净的吸水纸巾上拍打除去残留的洗涤液；然后每孔加入100μL稀释好的底物和显色剂，室温（18～28℃）下孵育2min（前30s需轻轻地振动96孔微量板）。

（6）再加入100μL的终止液阻止酶继续反应，轻轻振动96孔微量板30s，在酶标仪450nm波长下读取OD值。

阳性百分值（P）＝被检样品OD值/强阳性对照平均OD值

P大于20%即认为被检样品为阳性。

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