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动物源性食品中细菌的检测——布鲁氏菌

日期:07-04 作者:曲志娜,赵思俊等- 小 + 大

(6)结果判定 当阳性血清出现完全凝集(++++),而阴性血清无凝集(-)、抗原对照无自凝(-)现象时,试验成立,按以下对试验结果进行判定:
①受检血清出现“++”及以上凝集现象时,判定为阳性。
②受检血清出现“+”凝集现象时,判定为可疑。
③受检血清出现“-”时,判定为阴性。
4.3.2 虎红平板凝集试验(RBPT)
根据《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)。其方法是取被检血清、布鲁氏菌标准阴/阳性血清和布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原各25μL,滴加于玻璃板4cm2方格内,用灭菌牙签或混匀棒快速混匀血清和抗原,混匀后4min,在自然光下观察。在标准阴性血清不出现凝集、标准阳性血清出现凝集时,试验成立,方可对受检血清进行判定。出现肉眼可见凝集现象者判定为阳性(+),无凝集现象且反应混合液呈均匀粉红色者判定为阴性(-)。该试验反应敏感、稳定,特异性优于试管凝集反应,这种试验已在许多国家推广使用,常作为常规诊断方法之一。
4.3.3 全乳环状试验
全乳环状试验用于奶牛及奶山羊布鲁氏菌病检疫,以监视无病畜群有无该病感染,也可用于个体动物的辅助诊断。按《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)和《布氏杆菌检疫技术规范》(SN/T1088—2010)进行。操作步骤如下:
(1)取新鲜全乳样品1mL加入灭菌玻璃试管中,取布鲁氏菌全乳环状试验抗原50μL加入乳样中,充分振荡混合均匀。
(2)置37~38℃水浴中孵育60min,小心取出试管,勿振荡,立即进行判定。
(3)结果判定:判定时不论哪种抗原,均按乳脂的颜色和乳柱的颜色进行判定。
强阳性反应(+++):乳柱上层的乳脂形成明显红色或蓝色的环带,乳柱呈白色,分界清楚。
阳性反应(++):乳脂层的环带虽呈红色或蓝色,但不如“+++”显著,乳柱微带红色或蓝色。
弱阳性反应(+):乳脂层环带颜色较浅,但比乳柱颜色略深。
疑似反应(±):乳脂层环带不明显,并与乳柱分界模糊不清,乳柱带有红色或蓝色。
阴性反应(-):乳柱上层无任何变化,乳柱呈均匀浑浊的红色或蓝色。
4.3.4 间接酶联免疫吸附试验
间接酶联免疫吸附试验是检测布鲁氏菌病的国际贸易指定试验,操作步骤如下:
(1)用特异性抗原包被96孔酶标板,于4℃温孵18h,可直接使用,也可于-20℃冻存,用前于37℃30~45min解冻。
(2)用0.01mol/L的pH72磷酸盐缓冲体系(PBST)洗涤微量板4次以去除未吸附的抗原。
(3)第一列双孔加入1∶20稀释的强阳性、弱阳性、阴性对照血清和1×样品稀释液100μL作为平行对照,从第二列起单孔加入同等稀释度的被检血清100μL。室温(18~28℃)下孵育30min。
(4)用PBST洗涤微量板4次以除去其他未结合的血清,在干净的吸水纸巾上拍打除去残留的洗涤液;然后每孔加入100μL的用PBST稀释的酶标抗体,室温(18~28℃)下孵育30min。
(5)洗涤4次除去其他未结合的物质,在干净的吸水纸巾上拍打除去残留的洗涤液;然后每孔加入100μL稀释好的底物和显色剂,室温(18~28℃)下孵育2min(前30s需轻轻地振动96孔微量板)。
(6)再加入100μL的终止液阻止酶继续反应,轻轻振动96孔微量板30s,在酶标仪450nm波长下读取OD值。
阳性百分值(P)=被检样品OD值/强阳性对照平均OD值
P大于20%即认为被检样品为阳性。

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